Kuwahara, Mitsuhiko

Okayama University Scientific Achievement Repository

氏 名授 与 した 学 位専攻分野の名称学 位 授 与番 号学位授与の日付学位授与の要件学位論文の題 目桑原 光彦博 士農 学博甲第4279号平成23年 3月25日自然科学研究科 バイオサイエンス専攻(学位規則第5条第1項該当)キイロショウジョウバエ由来チオレドキシン還元酵素の新規酸化還元モチーフの機能解析論 文 審 査 委 員 教授 稲垣 賢二 教授 木村 吉伸 准教授 田村 隆学位論文内容の要旨セレンは食品中に含まれる微量必須元素であり,坑酸化作用や免疫賦活化作用等の生理活性を示し,疫学的研究からがん予防効果を持つと提唱されている｡その一方で,セレン含有チオレドキシン還元酵素(TrxR)が肺がん細胞で高発現することが知られており,細胞のがん化とセレン代謝について不明な点が多い｡噛乳類由来の TrxRは 53kDa(499アミノ酸)サブユニ ッ ト 2量体構造 を持つ｡その C末端配列トGly-Cys-See-Gly(end日の後ろから2番目にセレンをSeCysという特殊なアミノ酸残基の形で持っている｡TrxRを遺伝子操作により人為的に高発現させるためにSeCys498をCysに置換したCys型酵素は,野生型酵素の 0.1%以下の活性 (<50mU/mg)に低下する0本研究では,キイロショウジョウバエ(PTOSOPhiJameJanogasfeI)由来TrxRの触媒メカニズムを応用してCys型酵素の活性回復をはかり,TrxRの細胞内での機能を解析するための組換え型酵素の開発を目的とする｡まず,発現ベクターpQE30を用いての組換え型TrxRの大量発現系の構築を試みた｡可溶化のためのTrxタグを付加させずに発現させるため,この系ではタグ切断の必要なしに簡便にNiカラムで精製ができる｡pQE30はT5ファージ由来の強力なプロモーターを持つため,変異を起こして強力になったリプレッサーをコードするJacP遺伝子をもっている大腸菌NovaBlueを用いて発現させたが,僅かにしか目的の酵素を回収できなかった｡組換え型 TrxRの発現には,pET32aベクターを用いてチオレドシキンタグを付加した融合蛋白質として発現させてアフイニティ担体で簡便に精製した後,エンテロキナーゼ処理によりタグを切り離す方法を確立した｡DⅧTrxRは SeCys残基を持たないが高い酵素活性を示す｡DmTrxRの活性には,C末端の 4アミノ酸配列トSe卜Cys-Cys-Ser-OH)が必須であると報告されているが,これをヒトのhTrxRに導入しても酵素活性は発現しなかった｡そこで,分子軌道計算MOPACを用いてDmTrxRの酸化還元モチーフを探索した結果, 2残基上流まで含めた6アミノ酸配列(Pro-‡-Ser-Cys-Cys-Ser-OH)により酸化還元触媒として機能する可能性が示されたのでhTrxRlへの導入を検討した｡ヒト肺由来TrxRl遺伝子を発現ベクターpET32aに連結し, C末端配列を上記の配列に改変した｡ついで,0.3mMIPTG存在下で低温下,長時間(18℃,22h)の誘導を行い,精製した融合蛋白質のTrxタグ切断を経て目的蛋白質を調製した｡P‡SCCS型酵素はDTNBを基質にした反応では,Km値 1.26mM,比活性434mU/mgを示したOこれはProを導入していないSCCS型酵素(比活性50mU/mg)と比較して,約9倍の比活性の上昇といえる｡MOPAC計算によると,Pro残基の疎水面がジスルフィド架橋形成を促進する効果を持つことが予測された｡P‡SCCS型酵素は 血at値はセレン含有酵素よりも低いがSeCysを持たない酵素は,人為的高発現が可能なので,研究用酵素としては有用と考えられる｡さらにMOPAC計算によるDmTrxRのC末端配列が取り得る安定な立体配座を解析した結果,4つの立体配座T-/ト /`CI/C-の内,CIフォームが最も安定であることが予測された｡論文審査結果の要旨セレンは食品中に含まれる微量必須元素であり,抗酸化作用や免疫賦活化作用等の有益な生理活性を示す｡晴乳類由来のTrxRはC末端配列トGly-Cys-Sec-Gly(end)]中にセレノシステイン(Sec)を持つセレン酵素である｡TrxR は分子レベルで詳細な反応機構研究が積み重ねられてきたが,細胞レベルでの機能解明に向けた研究は進展が乏しい｡その主な要因としてSec導入の翻訳過程は特殊な機構で制御されているので,組換え蛋白質として TrxR を細胞内で発現させることが困難であることが挙げられる｡SecをCysに置換したCys型TrxRは組換え蛋白質としての発現が可能であるが,その活性は野生型酵素の0.1%以下である｡ところがキイロショウジョウバエ由来のホモログ酵素 DmTrxRでは,C末端配列にsec残基を持たないがは乳類TrxR と同程度の触媒能を持つ｡そこで本研究では,DmTrxR の触媒メカニズムを解明しSecを必要としないほ乳類TrxRの開発に取り組んだ｡まず,発現ベクターpET32aを用いて組換え型TrxRの大量発現系の確立を検討した｡可溶化のためのTrxタグ,アフイニティ担体による精製を目的とした Hisタグを融合した蛋白質として発現系を検討したOさらにこれらのタグをエンテロキナーゼ処理により切り離す方法を確立したOつぎにDmTrxRの活性には,C末端の4アミノ酸配列トSer-Cys-Cys-Ser(end)]の2つの Ser残基が重要と報告されていたので,この配列をヒトのhTrxRに導入したが検出可能な酵素活性は発現しなかった｡そこで,分子軌道計算MOPACを用いてDmTrxRの酸化還元モチーフを探索した結果,さらに2残基上流まで含めた配列【pro-Ala-Ser-Cys-Cys-Ser(end)]が酸化還元活性を有する可能性が示されたのでこれらpro残基の導入を図った｡その結果,ヒト肺由来TrxRlはCTNBを基質にした反応では,Km値 1.26mM,比活性434mU/mgを示した｡これはproを導入していないSCCS型酵素 (比活性50mU/mg)と比較して,約9倍の比活性の上昇といえる｡MOPAC計算によると,Pro残基の疎水面がジスルフィド架橋形成を促進する効果を持ち,pro残基は2つのSer残基と共に酸化型のC末端配列が取り得る安定コンフォマ-の中でC+型を最も有利にすることで酸化還元モチーフとして触媒サイクルを完結させることが示唆された｡上記の論文内容,発表会における応答を総合的に審査した結果,博士の学位に値するものと判断した｡

キイロショウジョウバエ由来チオレドキシン還元酵素の新規酸化還元モチーフの機能解析

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