Kohira, Naoki

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緑膿菌の多剤排出ポンプ遺伝子muxABC-opmB及びemrEPaeの発現上昇メカニズムの解析

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氏 名 小平 尚輝 授与した学位 博士 専攻分野の名称 薬学 学位記授与番号 博甲第 4105 号 学位授与の日付 平成２２年３月２５日 学位授与の要件 博士の学位論文提出者  （学位規則第５条第１項該当） 学位論文の題目 緑膿菌の多剤排出ポンプ遺伝子muxABC-opmB及び emrEPaeの発現上昇メカニズムの解析 論文審査委員 教授 土屋 友房  教授 岡本 敬の介  教授 森山 芳則    学位論文内容の要旨   近年、多剤排出ポンプが、臨床現場における抗菌薬耐性だけではなく、細菌の生存戦略つまり抗菌薬や重金属などを含めた環境からのストレスに対抗するシステムの 1 つとしても認識されてきている。緑膿菌における例として、抗菌薬などによって生じた酸化ストレスに repressor である MexR が反応することで、多剤排出ポンプ MexAB-OprM の発現を上昇させ、酸化ストレスの原因物質を菌体外に排出することが報告されている。また、多剤排出ポンプ MexXY がリボソームに作用する抗菌薬により誘導され、それらを排出することでリボソームを守ることも報告されている。しかしながら、緑膿菌の染色体上には多数の多剤排出ポンプ遺伝子が存在しているものの、それらがどの様にして発現上昇し、そしてどの様にストレスに対抗するのかは明らかにされていない。以上のことを踏まえ、本研究では緑膿菌を抗菌物質に曝し、多剤排出ポンプ遺伝子の発現上昇株を分離し、その変異株の解析を行うことでその発現上昇のメカニズムを解析することを目指した。  まず、数種類の抗菌物質を用いて抗菌物質の MIC が上昇した株を複数分離した。それらの中で、novobiocin 又は ethidium bromide を用いて分離した変異株において複数の抗菌物質の MIC (minimum inhibitory concentration)が上昇していた。そこで、それらについて解析を進めた。  Novobiocin を用いて分離した株の内、2 株の aztreonam、macrolides、novobiocin の MIC が上昇していた。この基質特異性より、その 2 株における MIC の上昇には多剤排出ポンプMuxABC-OpmB が関与していることが考えられた。そこで、muxA 遺伝子の発現を測定したところ 2 株ともその発現が上昇していた。そして、変異部位の同定を試みたことで promoter 領域付近の T の挿入によりその発現が上昇することを明らかにした。また、未知の regulator が存在する可能性を示唆した。  Ethidium bromide を用いて分離した株では acriflavien、ethidium bromide、tetraphenylphosphonium chloride (TPPCl)の MIC が上昇していた。そして、解析を進めたところ 12 株中 11 株において多剤排出ポンプ遺伝子 emrEPaeの発現が上昇しており、これが変異株における抗菌物質の MIC の上昇の原因であることを明らかにした。更に、emrEPae 遺伝子の発現には activator であるEmrT(emrEPae Transcriptional regulator)が関与していることを明らかにした。そして、EmrT はアミノ酸残基の置換により立体構造が変化し、activator としての活性が上昇することが分かった。このことより、通常でも EmrT は何らかの因子が関わることで立体構造が変化し、emrEPae 遺伝子の発現を制御していることが示唆された。  論文審査結果の要旨   緑膿菌は院内感染の主要な原因菌の一つである。この菌は元々多くの抗菌薬に耐性（多剤耐性）を示す上に、治療に用いられる抗菌薬に曝されることによりさらなる耐性（多剤高度耐性）を獲得しやすい。そしてこの性質が緑膿菌による感染症の治療を難渋化させている。この菌の多剤高度耐性化には多剤排出ポンプの発現上昇が関わっている例が知られている。ゲノム情報の解析によりこの菌には約３５個の多剤排出ポンプ遺伝子が存在することがわかっているが、その多くは未解析である。この論文の筆者は、緑膿菌を抗菌物質に曝すことにより多剤耐性化した変異株をたくさん分離し解析した。結局二つのグループの多剤耐性変異株が取れた。１）一つのグループのものは観察された多剤耐性に多剤排出ポンプ MuxABC-OpmB と EmrE が関与していることがわかった。特に耐性度の高い株について調べたところ、muxABC 遺伝子の発現が上昇していた。遺伝子をクローニングしシーケンスを調べたところ、推定プロモータ領域の―１０領域にＴの挿入があることがわかった。この挿入によりプロモータ活性が上昇したことがわかった。２）もう一つのグループでは多剤排出ポンプ EmrE が関与していることがわかった。やはり遺伝子レベルで発現が上昇していることがわかった。しかしそのプロモータ領域に変異は無かった。emrE 遺伝子の上流にレギュレーター様のタンパク質をコードする遺伝子があり、その遺伝子中に変異が見つかった。遺伝子破壊等によりこの遺伝子の産物（EmrT）が emrE のアクチベータとして働くことを明らかにした。このように、この論文は緑膿菌の多剤高度耐性化に係る多剤排出ポンプの発現上昇機構を明らかにしたものであり、大変興味深い結果である。この論文の内容は博士論文の審査基準に照らし学位に相応しいものであると判断した。   

緑膿菌の多剤排出ポンプ遺伝子muxABC-opmB及びemrEPaeの発現上昇メカニズムの解析

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