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FAK阻害が癌骨破壊病変に与える影響

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論 文 要 旨 等 報 告 書氏 名 栗 尾 奈 愛授 与 し た 学 位 博 士専攻分野の名称 歯 学学位授 与の番号 博 甲 第 40 94 号学位授 与の日付 平 成 2 2 年 3 月 2 5 日学位授 与の要件 医歯薬学総合研究科病態制御科学専攻(学位規則第4条第1項該当)学 位 論 文 題 名 FAK阻害が癌骨破壊病変に与える影響論 文 審 査 委 員 教授 佐々木 朗 教授 長塚 仁 教授 滝川 正春学 位 論 文 内 容 の 要 旨【 緒言 】骨を転移標的臓器とする悪性腺癌は乳癌,前立腺痛,肺癌,甲状腺癌,腎癌,悪性黒色腫,､口腔癌などが知られているo骨転移が直接生命を脅かすことは少ないが,著しい骨痛,病的骨折,高カルシウム血症などを合併し患者の QOLを著しく低下させる.また骨に転移した癌に対しては既存の抗癌剤療法が奏功しにくい｡そのため骨微小環境下での癌細胞の増殖を制御する分子メカニズムを明らかにすることが癌骨転移治療の新たな治療法の開発に不可欠であるO接着斑キナーゼ (血rcaladhesionkinase;FAR)は125kDの非受容体型チロシンキナーゼであり細胞増殖,生存,移動における重要なメディェ-クーである｡FAKは悪性腫癌,特に浸潤転移能の高い細胞において高発現しているが癌骨転移病変に関する報告はないCまた近年FAK選択的分子標的薬であるTAE226による腫療増殖抑制効果や転移抑制効果が報告されているが癌骨転移病変における TAE226の有効性については明らかとなっていない｡本研究ではヒト乳癌細胞株MDA･MB･231細胞をヌードマウスの心腔内に授与して作製した癌骨転移モデルに対するTAE226の有効性を検討し,さらに破骨細胞性骨吸収に与える影響について検討した｡【 材料および方法 】1.癌骨転移に封するTAE226の治療効果に関する桧討1)癌骨転移モデルの作製 :ヒト乳癌細胞株 MDA･MB･231細胞をヌードマウスに心腔内投与して作製した骨転移,破壊モデルにTAE226を経口投与し,その効果に対してⅩ線学的,病理組織学的な評価をおこなった｡2.TAE226の抗腫癌効果に対する検討1) TAE226の細胞増殖,細胞遊走,細胞形態に与える影響に関する検討 :MDA･MB･231細胞に各濃度のTAE226を添加し細胞増殖はトリチウムチミジンの取り込み量,細胞遊走に関してはSCratChaSSay,細胞形態に関しては免疫蛍光染色でアクチンの形態について評価した｡2) InvivoにおけるTAE226の腫癌増殖に与える影響:MDA･MB･231細胞をヌードマウスの背部皮下に移植し,腫療生着後にTAE226を経口投与し,腫癌重量,腫疲体積について検討した｡3.InvitroにおけるTAE226の破骨細胞性骨吸収抑制機構に関する検討1) 破骨細胞形成系に与える影響:マウス破骨細胞前駆細胞であるRAW264.7細胞にSOlublereceptoractivatorNFJCIBligand(以下sRANXL)を添加し培養する破骨細胞分化系に対し各濃度のTAE226を添加して培養し,破骨細胞マーカーであるTRAP陽性多核細胞数をカウントし,破骨細胞形成の評価をおこなった｡2) TAE226が破骨細胞分化シグナルに与える影響 :RANKL で誘導 されるAKT,ERE,p38IFC･Bのリン酸化 分化のマスターレギュレーターであるNFATclの発現にTAE226が与える影響をウェスタンブロッティング法を用いて検討したC3)破骨細胞の骨吸収活性に与える影響 :RAW264.7細胞を OAAS骨基質プレー ト上で成熟破骨細胞-分化させた後,各濃度のTAE226を添加し,5日後に形成された骨吸収寮の面積を測定したOまた免疫蛍光染色をおこないアクチンリング形成に与えるTAE226の効果も同時に検討した04) 成熟破骨細胞の骨吸収活性化シグナル-の影響 :成熟破骨細胞の骨吸収マーカーであるNFATcl,カテプシンK,TRAPの発現に与える影響をウェスタンブロッティング法を用いて検討した｡5)TAE226の細胞増殖能,細胞遊走能,接着能に与える影響 :RAW264.7細胞に各濃度のTAE226を添加し細胞増殖能についてはトリチウムチミジンの取り込み量を,遊走能,接着能に関してはscratchassay,adhesionaSSayをおこない検討したO【結果 】1_.骨転移モデルに対するTAE226_の効果TAE226はⅩ線学的,病理組織学的に対照群と比較し有意に骨転移ならびに骨髄内での腫癌細胞の増殖を抑制した｡また対照群と比較しTAE226投与群において破骨細胞性骨吸収を示すTRAP陽性多核細胞の出現の有意な減少が確認された02.TAE226の抗腫疲効果に対する影響TAE226はinvitroにおいて0.01FLM より濃度依存的な腫療増殖抑制効果を示し,アクチン線維の構造変化とともに細胞遊走を抑制した｡invivoにおいて腫療体積,腫療重量の増大を抑制した｡3.InvitroにおけるTAE226の破骨細胞性骨吸収に与える影響InvitroにおいてTAE226は0.1FLMの濃度から濃度依存的にRAW264.7細胞の細胞増殖能,細胞遊走能,細胞接着能を抑制し,破骨細胞の分化および成熟破骨細胞の骨吸収活性を抑制したoTAE226はRANXL下流の破骨細胞分化シグナルを濃度依存的に抑制し,また骨吸収マーカーのタンパク発現も濃度依存的に抑制した｡【 考察 】本研究では高転移性乳癌細胞株M])A一MB･231細胞をヌー ドマウスに心腔内投与して作製した骨転移モデルに対して TAE226を経口投与する事による治療的効果にについて検討し,TAE226が骨転移における骨髄内での腫癌細胞の増殖を抑制し,破骨細胞性骨吸収を抑制する事を明らかにした｡TAE226の破骨細胞性骨吸収抑制機構としては,1)腫癌細胞の FAX の リン酸化を抑制す る事による,抗腫疲効果によりMDA･MB･231細胞が産生するPTHrP等のサイトカインが減少することによる二次的な被骨細胞性骨吸収抑制効果,2)TAE226が破骨細胞性骨吸収を直接的に抑制することが考えられた｡MI)A･MB･231細胞に対するinvitro,invivoでの検討からTAE226が腫癌細胞の増殖,接着,遊走を阻害する事による抗腫蕩効果が確認 されたQまたRAW264.7細胞に対するinvitroの解析から,RAW264.7細胞に対しても細胞増殖,接着,遊走能を抑制することによりRANM シグナル経路を抑制し,RAm 下流の破骨細胞分化シグナルを阻害することにより破骨細胞分化を抑制し,骨吸収活性マーカーであるNFATcl,カテプシンK,TRAPの発現を阻害する事により骨吸収活性を抑制する事が明らかとなり,破骨細胞性骨吸収を直接的に抑制する可能性が示唆されたO【 結論 】TAE226によるFAK阻害は抗腫疲効果,破骨細胞性骨吸収抑制作用をともに併せ持ち,癌骨転移に対しFAKが有用な治療標的となる可能性が示唆された.論 文 審 査 結 果 の 要 旨骨を転移標的臓器とする悪性腫癌は乳癌､前立腺癌､肺癌､甲状腺癌､腎癌､悪性黒色腫､口腔癌などが知られている｡骨転移が直接生命を脅かすことは少ないが､著しい骨痛､病的骨折､高カルシウム血症などを合併し患者のQOLを著しく低下させる｡また骨に転移した癌に対しては既存の抗癌剤療法が奏功しにくい｡そのため骨微小環境下での癌細胞の増殖を制御する分子メカニズムを明らかにすることが癌骨転移治療の新たな治療法の開発に不可欠である｡接着斑キナーゼ (focaladhesionkinase;FAR)は125kDの非受容体型チロシンキナーゼであり細胞増殖､生存､移動における重要なメディェ一夕-であるoFAX は悪性腫癌､特に浸潤転移能の高い細胞において高発現しているが､癌骨転移病変に関する報告はないOまた近年FAK選択的分子標的薬であるTAE226による腫疹増殖抑制効果や転移抑制効果が報告されているが､癌骨破壊病変におけるTAE226の有効性については明らかとなっていない｡本研究ではヒト乳癌細胞株 MDAIMB･231細胞をヌー ドマウスの心腔内に投与して作製した癌骨転移モデルに対するTAE226の有効性を検討し､さらに破骨細胞性骨吸収に与える影響について､マウス破骨細胞前駆細胞であるRAW264.7細胞を用いて検討することにより､以下の結論を得ている｡1.マウス骨転移モデルにおいてTAE226はⅩ線学的､病理組織学的に対照群と比較し有意に骨髄内での腫癌細胞の増殖を抑制した.また対照群と比較しTAE226投与群において破骨細胞の存在を示すTRAP陽性多核細胞の出現の有意な減少が確認された｡2.TAE226はマウス破骨細胞前駆細胞RAW264.7細胞の細胞増殖能､細胞遊走能､細胞接着能を抑制し､RANKL下流の破骨細胞分化シグナルを濃度依存的に抑制した｡また成熟破骨細胞における骨吸収マーカータンパク発現も濃度依存的に抑制した｡以上の結果から､癌骨破壊病変において､TAE226によるFAX阻害が腫療増殖抑制効果のみならず､破骨細胞前駆細胞の破骨細胞分化や破骨細胞の骨吸収活性を直接的に抑制する可能性がⅩⅩ示唆されたCこれらの知見は癌骨破壊病変の新たな治療法の開発に対し一つの方向性を示唆するものである｡よって､本論文は博士(歯学)の学位論文に値するものと認めた｡

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