先に開発した過酸化水素のフローインジェクション分析法（FIA）のシステムや触媒カラムに詳細な検討を加え，ppbレベルの過酸化水素の定量法を開発した。また，本研究で得られたFIAを用いて，57～944ppbになるように過酸化水素を雨水に添加し，回収実験を行った。その結果，回収率と再現性とも良好で，化学発光法より優れていた。なお，FIAでの検出下限は，約10ppbであった。We tried to determine a low-level hydrogen peroxide by using a flow injection analysis (FIA) which was reported in our previous paper. For this purpose, the constituents of the system including the catalytic column were re-examined in detail. As the result, we developed a new system of the FIA which is available for the determination of ppb-order hydrogen peroxide. When hydrogen peroxide spiked in rain-waters(57-944ppb)was analyzed by the FIA, better recovery and reproducibility were attained compared to chemiluminescent analyses. The lower-limit of determination was 10 ppb hydrogen peroxide

Akizawa, Hiromichi

Iwado, Akimasa

Mifune, Masaki

Mukuno, Takashi

Saito, Yutaka

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Flow Injection Analysis for Hydrogen Peroxide in Environmental Waters

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論 文過酸化水素のフローインジェクション分析の　　　　　　　　　　　環境水への応用岩藤章正1），椋野　貴1），秋澤宏行2），御出正樹3），齋藤　寛3）要　　旨　先に開発した過酸化水素のフローインジェクション分析法（FIA）のシステムや触媒カラムに詳細な検討を加え，ppbレベルの過酸化水素の定量法を開発した。また，本研究で得られたFIAを用いて，57～944ppbになるように過酸化水素を雨水に添加し，回収実験を行った。その結果，回収率と再現性とも良好で，化学発光法より優れていた。なお，FIAでの検出下限は，約10ppbであった。緒　　言　環境に存在する水，とくに雨水には，オキシダント由来の過酸化水素が含まれている可能性がある。そこで，本研究では，雨水中に含まれる可能性のある低濃度の過酸化水素を簡便かつ高感度に定量分析するため，フローインジェクション分析法（FIA）について検討を加えることにした。一方，著者らは，金属ポルフィリン（M－P）を担持したイオン交換樹脂（M－P．）が種々の酵素様機能を持ち，5），とくにそのペルオキシダーゼ様機能を利用すれば，過酸化水素を吸光光度定量できることを既に明らかにした6）。さらに1最近，M－P，のペルオキシダーゼ様機能を利用し，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用ポンプを組み込んだFIAシステムを用いれば，過酸化水素を簡便にFIA分析できることを報告した7）。その際，開発したFIAを用いれば，過酸化水素の微量定量の可能性を示唆したが，実際に雨水などの環境水に予想されるppbレベルの過酸化水素の定量についての検討は行わなかった。そこで，本研究では，FIAのシステムや触媒カラムにさらに詳細な検討を加えるとともに，FIAによるppbレベルの過酸化水素の定量を試み，環境水中に予想される程度の過酸化水素のFIAによる微量定量の可能性を検討することにした。実　　験1）試薬および金属ポルフィリン（M－P）　　関東化学社製のポルフィリンをそのまま使用　し，常法にしたがって，対応するマンガンー，　コパルトーおよび鉄一ポルフィリン錯体（M－　P）へと変換した。Phenolや4－aminoanti－pyrineなどの色原体は，関東化学㈱，和光純薬㈱およびナカライテスク㈱製などの試薬特級　を使用した。緩衝液用の試薬としては，原則と　してJIS特級や標準試薬を，その他の試薬や溶　媒も原則として試薬特級またはHPLC用特殊　試薬を使用した。2）イオン交換樹脂　　検討に用いたアニオン交換樹脂は，Dowex　SBR－P，1－X8，　MSA－1やMSA－2，およ　びAmberlite　IRA400，　IRA900やCG400など計16種，また，カチオソ交換樹脂としては，Dowex　MSC－1やMSC－50WおよびAmberIite　IR120－Bなど計6種である。これらは，一22一　いずれも，1mol／e硝酸と水酸化ナトリウム　で交互に数回洗浄した後，酸または塩基が流出　しな：くなるまで，逆浸透イオン交換水で洗浄した。さらに，樹脂を完全に乾燥するため，アセ　トソで数回洗浄した後，風乾した。3）金属ポルフィリン担持イオン交換樹脂（M－Pr）の調製　　Mn3＋一tetrakis（4－sulfophenyl）porphine担持樹脂（Mn－TSPPr）を調製する場合を例に　あげると，Mn3＋一tetrakis（4Tsulfophenyl）pOrphine　（Mn－TSPP）水溶液（1．Omol／のに硝酸型の陰イオン交換樹脂Dowex　MSA一　1（100－200mesh）を入れ，約35℃で，液が透明になる　まで（2－3時間）振とうし，完全にMn－TSPPをMSA－1に担持させた。次いで，担持樹脂をろ即し，アセトンで洗浄した後，風乾　させた。このようにして得られた樹脂は，乾燥樹脂1gあたり25μモルのMn－TSPPが担持　されている。同様に他のM－Pもイオン交換樹脂に担持した。なお，カチオソ性金属ポルフィ　リソを担持するには，MSC－1などの陽イオン交換樹脂を用いた。4）触媒カラムとその調製　　先に開発した方法7）では，2．6×50mmの液体　クロマト用ステンレスカラムを使用したが，本研究では，微量の過酸化水素を定量するために，4．0×10㎜のステンレスカラムあるいは1．0×100㎜のステンレスまたはテフロンチューブをカラムの代わりに使用した。M－P，をカラムに充てんするには，乾式法を用いた。なお，チューブをカラム代わりに用いた場合には，前後に脱脂綿を詰め，M－P，が流出しな：いように工夫　した。5）FIAシステムと定量操作　　図1にFIAシステムの概略を示す。カラム　と試料注入部のサイズが異なる他は，基本的にcPs試料注入ロ D W。一一kL＿＿ゴR．C．図1　FIAシステムの概略前平7）と同じものを使用した。定量操作は，試料注入部S（50μeループ）8）より，試料溶液（1． p m未満）を注入し，触媒カラム（R．C．）で生成したキノイド型色素を紫外可視検出器（D，505nm）で吸光度を測定し，ピーク高法による検量線から過酸化水素量を求めるという簡便なものである。また，試薬溶液Rと精製水CをポンプPで，それぞれ流速1．5m2／minで流した。なお，試薬溶液は前報と類似のphenol水溶液（14㎎／mQ），4－aminoantiyipyrine水溶液（1，0㎎／mQ）およびホウ酸塩緩衝液（0．1mol／e，pH8．5）の1：1：4混液である。　また，比較に用いた化学発光法には，日四望理科機械製作所製のフロー式ルミカウンターやデジタルフォトメーターなどを用いた。結果および考察1　担持樹脂および色原体などの選択　　図2に本研究で検討した金属ポルフィリン　（M－P）の構造を示した。いずれも，側鎖に　カチオンあるいはアニオン基を持ち，水溶性で　イオン交換樹脂とイオン結合のみならずπ一π　電子相互作用などの物理的相互作用によって，　イオン交換樹脂に強く担持され，容易には溶離　しない4’5）。本研究では，これらのM－Pおよ　び種々のイオン交換樹脂を組み合わせて各種の丁丁樹脂を調製し，そのペルオキシダーゼ様活性を，pheno1／4－aminoantipyrine系による検量線の傾きから評価検討した。その結果，pH一23一R?????、? ?ノノ??N? ?、??＼、＼RR：OSO3’％SO3一　　　SOゴ◎一義表1　水素供与体の影響水素供与体　　　　相対吸光度　　（％）t30mmカラム　　　60　mmカラム　　　100　m皿カラム4so，一　　sphenol　100pchlorophenoi　149diethylanilinecrchlorophenc1　38p－metboxyphenDI???10014849407Ocoo一O’N－CH，coo’　図2　ポルフィリンの構造8．5付近の緩衝液を用いる限り，Mn－TSPP，以上に優れた活性を持つ樹脂は見いだせなかった。しかし，pHが10．5とアルカリ性が強い領域では，Co3＋一tetrakis（1－methylpyridium－4－yl）porphineを担持した陽イオン交換樹脂DowexMSC－1（Co－TMPyP，）を用いた場合，検量線の傾きは，Mn－TSPP，を用いた場合の1．85倍と優れていた。しかしながら，本研究では，Co－TMPyP，を用いると緩衝液の影響を受けやすいこと，およびポンプを含むシステム全体の保守の容易さなどの面から，前報7）と同じくはぼ中性の緩衝液が使用できるうえ，緩衝液の影響を受け難いMn－TSPP，を用いることにした。　一方，色原体のうち水素供与体として最も一般的なものはphenolであるが，表1に示すような供与体もよく知られている。そこで，長さの異なる内径1．OmmのMn－TSPP，テフロンチューブを用いて水素供与体のピーク高に及ぼす影響を検討した。その結果，表1に示すように，かchlorophenolを用いた場合，　phenolを用いた曹Pheno1を用いた場合を100％とする。場合の約1．5倍のピーク高が得られたが，その他の3種の供与体では，いずれの長さのチュー　ブでも，phenolを用いた場合の半分未満のピー　ク高しか得られなかった。しかし，バッチ法で　Achlorophenolとphenolを用いた場合の反応速度を検討したところ，平衡に達するまでの時間は，phenolの方が短く，かchloropheno1の場合の半分程度であった。そこで，本研究で　は，実際試料に適用する場合には，反応阻害質の存在も予想されるために，安全を見込み，反応が早く進行するphenolを用いる系を使用す　ることにした。なお，以下に述べるように，phenolを用いる系であっても，感度は充分満足のいくものであった。2）検量線，再現性および繰り返し使用　定量操作に従って得られたMn－TSPP，ステ　ソレスチューブ（1．0×100㎜）による高濃度域の検量線とピークを図3に示す。図3からもわかるように，ピーク形状は良好で，検量線も良好な直線となった。また，検出下限をシグナルとノイズとの比（S／N比）で2とすると，検出下限は，すくなくとも10ppbと満足できるものであった（図3参照）。さらに，再現性を過酸化水素標準液（280ppb）を用いて検討した結果，10回繰り返しによる変動係数は0．50％と極めて良好であった。さらに，4．0×10㎜のMn－TSPPrカラムを用いて，1日あたり50回，6日間，計300回繰り返し過酸化水素標準液（0．9一24一200ge?St　ioooo??／925　ppb　・　lo．oo2　ABs，446　ppbIII　220　ppb　　　　　　　　　　　　　　O　　　　　　　IO曲．　　　　　　　　　　　　　　エひ　り　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　リヒ臆　砦　牌鯉壷　　　　過酸化水素濃度　　　　　　　　　　　0　　　　　10m血．　　図3　検量線とフローシグナル表2　繰り返し注入の影響注入回数 1　50　100　150　300相対ピーク高k　lOO　　102　　　10298　103“1回目の注入時に得られたピーク高を100とする。ppm）をインジェクションし，ピーク高を検討　した。その結果，表2に示すように300回注入　してもピーク高の変動はわずかであり，Mn－TSPP．カラムは，繰り返し使用に充分耐え，実用的に満足できるものであった。3）過酸化水素の雨水への添加回収　　雨水には，過酸化水素と反応する物質が含まれているため9），実際に雨水を採取し，無処理で直接FIAを行うと，過酸化水素は全く検出　されなかった。そこで，雨水採取後の過酸化水素の分解を抑制するために，雨水100mQに0．5％　ピロリソ酸ナトリウム水溶液1Sm9を採取時に添加することにした。なお，過酸化水素を雨水に230ppbになるように添加して過酸化水素量の経時変化を検討した結果，ピロリソ酸ナトリウムを加えたものでは，添加後1時間程度は過酸化水素量に大きな変化はなかったが，ピロリン酸ナトリウムを加えない場合には，過酸化水素量は添加1時間後には10～48％まで減少した。　しかし，いずれの場合でも添加24時間後には，過酸化水素量は5％前後まで分解されてしまった。「 ｵたがって，ピロリソ酸ナトリウムを添加しても，雨水を試料とする限り，速やかに分析をする必要がある。　次いで，異なる時期に採取した雨水2試料にピロリソ酸ナトリウムを加え，さらに過酸化水素を57－944ppbになるように添加し，添加的1時間以内にMn－TSPP，ステンレスチューブ（1．0×100mm）を用いるFIAで回収実験を行った。その際，最も高感度であるとされている化学発光法（ルミノールとヘミン）9）でも過酸化水素の定量を行い，FIAの結果との比較検討を行った（表3）。その結果，表3からもわかるように，ここで用いたFIA法は，回収率および再現性とも化学発光法より優れていた。とくに，再現性の面では，57ppb程度の過酸化水素定：署した場合には，化学発光法では変動係数8．54％であるのと比較して，FIAでは変動係数が1．20％と極めて良好であった。　以上述べたように，本研究で用いたFIAは，ppbレベルの過酸化水素を再現性よく定量できる方法である。したがって，本研二究で得られたFIAは，今後種々の環境水中の過酸化水素の定量に利用できるものと期待できる。表3　雨水（地表採取）中の過酸化水素の回収実験試料　　　H202　　添加量雨水t　　（ppb） 測定値　　回収率　　変動係数　　測定値　　回収率　　変動係数　　FIAb）　｛ora ％．　n＝5 b化学発光法　ele｝　（％．　n＝5　　　，，2翻　　lll　　　igg92：????i：：??105016s?????，?，，g?????gg　？i？；鴛　1：：1105　3．14　　　　91：・雨水・@鑑　　　　1評91：???i：・；・，　li／ll’g 89g?????撫to．5％ピロリン酸ナトリウム18rnYIOOm　1を雨水に添加一25一謝　　辞　本研究を実施するにあたって，実験に協力を賜った関東化学㈱佐藤勝彦氏に感謝致します。脚注および文献1）岡山大学自然科学研究科2）周山大学薬学部3）岡山大学薬学部・岡山大学環境管理センター4）　Y．Saito　et　al．，　Reactine　Po！ymer，4，243（1986）5）　M．Mifune　et　al．，　Talanta，　38，779（1991）6）　Y．Saito　et　al．，Anel．　Sci．，3，171（1987）7）　M．Mifune　et　al．，　Anel．　Sci．，14，519（1998）8）前報では，20μ1のループを用いた。9）　K．Yoshizumi　et　al．，　AtmosPheric　Envz’ron－　ment，　18，395（1984）Flow　lnjection　Analysis　for　Hydrogen　Peroxide　　　　　　　　　　　　in　Environmental　WatersAkimasa　IWADO＊，　Takashi　MUKUNO＊，　Hiromichi　AKIZAWA”，　　　　　　　　　　Masaki　MIFUNE＊”　and　Yutaka’SAITO＊”　　　　　　　　’The　Graduate　School　of　Natural　Sciences　and　Technology，　Okayama　University　　　　　　　　　　　　　　　　　＊“Faculty　of　Pharmaceutical　Sciences，　Okayama　University＊”eaculty　of　Pharmaceutical　Sciences，　Okayama　University　and　Okayama　University　　　　　　　　　　　　　　　　　Administration　Center　for　Environmental　and　Technology　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Abstract　　We　tried　to　determine　a　low－level　hydrogen　peroxide　by　using　a　flow　injection　analysis　（FIA）which　was　’reported　in　our　previous　paper．　For　this　purpose，　the　constituents　of　the　systemincluding　the　catalytic　column　were　re－examined　in　detail．　As　the　result，　we　developed　a　newsystem　of　the　FIA　which　is　available　for　the　determination　of　ppb－order　hydrogen　peroxide．　Whenhydrogen　peroxide　spiked　in　rain－waters（57－944ppb）was　analyzed　by　the　FIA，　better　recovery　andreproducibility　were　attained　compared　to　chemiluminescent　analyses．　The　lower－lirriit　ofdetermination　was　10　ppb　hydrogen　peroxide　．一26一

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