Kikuchi, Tateki

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疾患モデル動物の開発と応用―糖原病Ⅱ型ウズラをめぐって―

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8疾患モデル動物の開発と応用一糖原病Ⅱ型ウズラをめぐって-菊 池 建 機国立精神 ･神経センター神経研究所特別講演要旨1.はじめに疾患モデル動物は医学 ･生物学の研究素材として役立つのみならず､その研究成果を通して人類の健康 ･福祉の増進に大きく貢献している｡ヒトの種々の難病の病因解明や治療法を兄いだすためには､ヒト自身を直接実験対象としたり､身体の一部より必要な実験材料を採ること等には自ずと限界があり､その方法によっては人道的､社会的影響から大きな制約を受けねばならない｡疾患モデル動物は､こうしたヒトで直接行なえない研究を可能としたり､疾患動物を通して病気の原因を明らかにしたり､治療の前臨床実験を可能にしてくれる｡2.疾患モデル動物一病因モデルと病態モデルー疾患モデル動物によりヒトの病気を研究する場合､生体機能を研究する際にその系を全体モデルか､部分モデルか､に分類したのと同じ分け方を当てはめることができる1)｡ 1つは､動物に起こっている疾患の直接の原因が､ヒトの病気の原因と同じ場合であり､もう1つは､その原因は異なっているが､発症のプロセスや臨床､病理所見､または外部環境や内部環境に対する反応が類似している場合である｡前者は病気の原因が同じなので病因モデル(疾患モデルとする場合もある)､後者は､疾患全体の症状が類似する病態モデルとして分類できる｡ヒトの場合も動物の場合も､遺伝性の疾患は､遺伝的基盤に立って発症し､その原因は遺伝子の異常にある｡現在研究に用いられている疾患モデル動物は突然変異体(ミュータント)として偶然発見されたものが多く､遺伝的支配下に発症する個体を継代繁殖し､必要に応じて実験素材として使っている｡ 突然変異体として発見された自然発症の疾患動物は､発見当初は､その病態が種々の角度から検査され､ヒトの種々の疾患にみられる病態との比較が行なわれる｡ 従って､大部分の疾患動物は､はじめは病態モデルとしてデビューし､遺伝病であることが明かとなっても､その病気の原因や､該当するヒトの病気等は不明のままに利用され始める場合が多い｡その後､異常蛋白質の発見や､遺伝子解析により､遺伝子レベルでの真の病気の原因がヒトのものと同一であることが明らかとなった時､この疾患動物はヒトの病因モデルとしてさらに高い評価を受けることとなる｡疾患モデル動物はヒトを対象とし得ない研究を可能とする一方､新薬開発や臨床実験-踏み切るに際しての毒性試験や治療実験を行なう上で有用である｡ ラットやマウスにみられる､最近の疾患モデル動物の急激な需要の伸びは､主にこの方面の研究に使われているためである｡ 以下に論ずる糖原病Ⅱ型ウズラ(AMI)ウズラ)は､18年前に発見されてからこれまで系統純化が行なわれてきたが2)3)4)5)､最近我々の研究グループが分子レベルの解析を行ない､本ミュータントがヒトの糖原病Ⅱ型と遺伝子レベルでも同一であることを明らかにした6)｡現在ウイルスベクターを介する遺伝子治療が試みられているが､ここではヒト型遺伝子組換え合成酵素(rG舶)を直接ウズラに投与する酵素補充療法について紹介する7)03.糖原病Ⅱ型(pompe病)とその動物モデル糖原病はグリコーゲンの合成､分解に関する代謝経路の酵素の先天的な障害により､肝臓や他の諸臓器､組織にグリコーゲンが蓄積し､それによってさまざまな病態を呈する遺伝性疾患である｡欠損する酵素の種類や､グリコーゲンの蓄積する部位によっていくつかの病型に分類される｡Ⅱ型はpompe病ともいわれ､acid-α-glucosidase(G血)または酸性マルターゼともいう酵素の欠損症である｡分解されないグリコーゲンは細胞内のリソソームに蓄積される｡臨床経過から､乳児期早期に発症して心不全で死亡する乳児型と､乳幼児期に筋緊張低下で発症して徐々に進行する小児型､および成人に発症して筋力低下を示す成人型に分類される｡乳児型では酵素が全く合成されず､早 く病気が進行するが､小児型や成人型では酵素の残余活性がみられ､進行は緩徐である｡ヒトの糖原病Ⅱ型のモデル動物として､牛､緬羊､犬､ウズラ等が知られている｡ これらの疾患動9物はウズラ以夕吊ま大型でライフスパンも長いため系統の維持までに至らず､すでに絶えてしまっているものもある｡ごく最近GAA遺伝子を欠失したKnock-outlDOuSeが報告されたが､軽度のグリコーゲン蓄積が心臓､骨格筋でみられるだけで､臨床症状が容易には把撞できず､マウスの本酵素を介する糖代謝がヒトとは異なることが指摘されている8)｡ 一方､ウズラの糖原病モデルは胸筋､心筋と肝臓に顕著なグリコーゲン蓄積を認め､さらに翼の挙上不能や仰向けの位置から起き上がれなくなる等の明瞭な臨床症状を伴う点で遺伝子変異マウスの場合と異なっている｡ヒトの糖原病Ⅱ型は心筋や肝臓に加えて､骨格筋も障害される点で他の代謝性蓄積病とは異なっている｡ウズラの本疾患モデルは､浅胸筋が骨格筋の中では最も早く､最も重度に侵される｡ 3週齢以降の浅胸筋線維の細胞質にはグリコーゲンの蓄積がみられるようになり､8週齢に達すると細胞質に拡散 しているグリコーゲンは大型のPAS陽性類粒(Glycogenosome)となる｡ また､筋線維内のリソソームの活性化がみられ､大小のautophagosomeが細胞内小器官を取り込んで､光顕所見では空胞として観察される(図1)｡ その後､病勢進展に伴い､筋組織は脂肪組織に置き変わる｡ これら一連の病理学的変化はヒトのそれと極めて類似している｡ さらに､ウズラは小型(100-130gm)で､個体を多数､簡単に揃えられる利点があり､疾患モデル動物として有利な点が多い｡残された問題はこのモデル動物の遺伝子変異がヒトの糖原病Ⅱ型と相同であるかどうかであった｡4,ウズラのacid-α-glucosidase(GAA)cDNAのクローニングと糖原病II型ウズラの遺伝子解析ウズラの糖原病(AMP)の原因遺伝子を分子レベルで解析するため､まず､正常なウズラのacid-αglucosidase(GAA)cDNAを単離した6)｡現在まで報告のあるヒト､マウス､テトラヒメナのアミノ酸配列のalignmentを揃え､保存性の高い活性中心部分のdegeneratepri皿erを合成した｡そのdegenerateprimerを用いて､40日齢のウズラのcI)NAを鋳型としたRT-PCR法によりウズラのこの部位のcDNAを増幅した｡この部位に対するpcR産物をprobeとして､40日齢のウズラの肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした｡ その結果3,569bpのインサート長を持つpQAM8を単離した｡本cI)NAクローンはメチオニンから最終コドンまでに､932アミノ酸残基からなるオープンリーディングフレームを有していた｡また､メチオニンよりも上流にはインフレームのストップコドンが存在することから､本cI)NAクローンがウズラGAAの完全長に対応するcDNAクローンと考えられた｡また､糖鎖の結合の可能性のあるアスパラギン残基が9カ所存在していた｡単離されたGAAcI)NAから推定されるアミノ酸配列とヒト､マウスGAAのアミノ酸配列のalign皿entをそろえてみると､今回単離したウズラのGAAアミノ酸配列が晴乳類のGAAに対し､全体で約52%のホモロジーを有していた｡また､知られている活性中心付近のアミノ酸残基はヒト マウス､ウズラ間で高く保存されていることが示された｡3種類の酵素のア図1 8適齢の糖原病Ⅰ型ウズラ浅胸筋線維の微細構造学的変化ェボン厚切切片をPAS染色すると筋線維内に大小の空胞 (Aの挿入図矢印)とグリコーゲン塊(Glycogenosome)(Bの挿入囲矢頭)が観察できる｡ 電顕観察では空胞は大型のautophagosomeで､内部には多数の不定形膜様構造物を含んでいる(A)｡ グリコーゲン塊は電子密度の高いグリコーゲン粒子の集合の場合と､電子密度が低く､明るいものがあるC3)｡スケール-1FLmミノ懐でN末端の相同性の低いのが特徴であるが､このことは､ヒトにおいて､N末端が何カ所か酵素消化的にprocessingされることが知られており､ウズラにおいてもN末端は成熟蛋白に含まれない可能性を示している｡クローニングしたGAAcI)NAに､ウズラのGAA活性が実際にあるかどうかを確認した｡pQAM8の推定コード領域を真核細胞の発現ベクターであるpcI)NA3に組み込み､pETAM8を作製した｡ 本発現ブラズミドをcos細胞または糖原病ウズラの9日目旺由来の線維芽細胞にLipofectAlnineregentを用いてtransfectionした｡90時間後に細胞を集めて､細胞のホモジェネ-トを得た｡その一部を4-MUを基質として､GAA活性を測定 した ｡ その結果､ベクターのみのMocktransfectionでは7.26mm01が得られたのに対して､pETAM8を用いた場合には210mmolと約28倍の活性の上昇を見た｡ また､本ウズラGAAはpH4.3と6.5の酸性と中性での活性を比較したところ､酸性領域に対して中性では活性が1/20になることを確認した｡これらの結果は､今回単離した､pQAMT8がウズラのGAAをコードしていることを示している｡GAAcDNAをプローブとしてNorthernblott解析を行ったところ､正常においては､先ほどのcDNAの全長に対応する約3.6kbのシングルバンドを得たが､糖原病ウズラ由来の各臓器は､殆どシグナルが観察されなかった(図2)｡ このことは､ウズラの糖原病I23456789101112図2正常および糖原病ウズラの諸日齢および諸臓器におけるNorthernblot解析正常ウズラは奇数､糖原病ウズラは偶数レーンにシグナ)i,を示す｡レーンlと2;一日齢肝臓､レーン3と4;84日齢肝臓､レーン5と6;35日齢心晩､レーン7と8;35E]齢浅胸筋､レーン9と10;84日齢内転筋､レーン11と12;35日齢脳｡糖原病ウズラのどの臓器を､どの日齢から採取してblottingしても皿RNAのシグナルは得られない｡10の理由がGAAmRNAの転写活性の減少または消失によることを示唆している｡ また､この減少の理由が､mRNAの安定性に影響を与える変異のためであるのか､またはプロモーターの変異のため､であるのかは現在不明である｡ さらに単離したGAAcDNAをプローブとして､正常および糖原病ウズラのgenomicI)NAをいくつかの制限酵素で消化 したものに対して､GenomicSouthernBlottingを行なった｡しかし､正常および糖原病ウズラのゲノム間でも目だった変異は現在のところ見出されていない｡5.酔素補充療法ヒトの糖原病Ⅲ型はGAAの異常低値により肝臓､心臓､骨格筋に大量のグリコーゲンが蓄積し､細胞内のリソソームがそれらを分解できず､ついには細胞死にいたる諸臓器不全を示す糖代謝病である｡ 正常細胞では粗面小胞体で合成された前駆体蛋白はGolgi体で糖鎖の付加を含むprocessingを受け､リソソーム-成熟したGAA分子を送る｡ここで､一部のGAA前駆体は成熟せずに細胞外へ出､血流にのって全身を循環する｡酵素が必要となった細胞は､自分で合成した酵素で間に合わない場合は血中から再び細胞表面の受容体を介 してGAA前駆体を取 り込み､Processingの後にリソソームでグリコーゲンの分解に再利用する9)｡酵素補充療法の原理は､血中にある酵素を再利用する仕組みが細胞に備わっていることを利用して､体外から酵素を投与してやるものである｡ 従って､細胞内の酵素が不足しないように定期的に体外から補充する必要があるため､酵素補充療法といわれている｡ 糖尿病の患者がインシュリンを定期的に注射するのと同じである｡ これまでの成功例としては脂質蓄積症として知られるゴーシェ病があげられる｡リソソーム酵素の一つであるβglucosidaseが欠損すると､グルコセレブロシドが肝臓や牌臓の網内系細胞に多量に蓄積するため､肝腺腫が顕著となる｡ β-glucosidaseを投与された患者の肝臓や牌臓の腫れは著しく目立たなくなり､殆ど正常のからだに戻ることが報告されている10)｡最近になって､培養下でCHO細胞に組換えDNA技術により､ヒト型GAAを大量に合成する系が確立した9)｡ この合成酵素を使って補充療法を試みるに際し､ウズラの細胞には酵素を取り込む ｢受容体｣が細胞表面に存在するか､また､一度取り込まれた酵素は実際にGolgi体でprocessingを受け､リソソームでグリコーゲンを分解する能力があるか､をウズラの9日巨艦由来の初代培養線維芽細胞と筋芽細胞を使って検討した｡GAAは糖鎖のmannnOSe-6-phos-phate(a-6lp)を介して受容体と結合するが､用いたウズラのいずれの細胞も細胞表面にこの受容体を有し､ヒト型酵素を取り込むことが判明した11)0また､一度細胞内にGAAが取り込まれるとGolgi体のifI近傍に集まり､以降7日間にわたって細胞内のグリコーゲンを分解し続けた｡個体レベルのGAAの投与実験はいくつかの投与量で､2-3日間隔で､また7回から16回投与を実施している｡ ウズラはヒト型の異種蛋白を連続投与されても､いわゆるアナフィラキシー反応による死亡例はみられず､若齢ウズラほど血中の抗体産生能が低いことなどから､異種蛋白による個体レベルの治療実験に適している動物と思われる11)｡ つい最近の個体レベルの一連の実験結果から､外部より投与されたGAAにより､肝臓と心臓のグリコーゲンの蓄積は速やかに消失し､胸筋線維のグリコーゲン穀粒の減少に伴い､筋病変も著しく改善されることが明かとなった7)｡6.おわりに遺伝性の疾患モデル動物の一例として､糖原病Ⅱ型ウズラを応用した最近の研究成果を紹介 した｡遺伝子改変技術により､遺伝子異常を伴う疾患モデルマウスやラットを作製できるこの頃なのに､なぜウズラなのか､と思われる方も多いと思います｡しかし､疾患モデル動物という場合は､動物の種を問わず､病気を発症している個体が重要である､という点を思いだして下さい｡そして､前述したように､ヒトの遺伝病と遺伝子異常が同じ場合は､どのような動物でも疾患モデルとして大きな価値を持つことになります｡すなわち､遺伝子異常がヒトの遺伝病と同じでも､動物で表現型としての症状がみられなかったり､ヒトの疾患と違う症状を示す場合は､疾患モデル動物として適しているとは言えないわけです｡この分野の研究は､広 く医学､生物学にまたがる技術革新が必要とされ､ヒト疾患の発症機序､その治療法の開発および新薬開発等の研究に果たす役割は大きいといえます｡7.文 献1)菊池建機.疾患モデル動物-その医学 .生物学-の応用一日本薬剤師学会雑誌,42,633-642,1990.2)MurakaniH.,TakagiA.,NonakaS.,IshiuraS.andSugita冗.GlycogenosisⅡ inJapanesequails.Exp.Anin.(Tokyo).29,475-485,1980.3)UslkiF.,IshiuraS.andSugital.Developmentalstudyofα一glucosidaseinJapanesewithacidmaltasedeficiency.MuscleNerve.9,5371543,1986.4)HiguchiI.,NonakaI.,UsukiF.,IshiuraS.andSugitafl.AcidnaltasedeficiencyintheJapanesequail:earlymorphologicaleventinskeletalmuscle.ActaNeuropathol.73,32-37,1987.5)Miyagawa･TomitaS.,MorishimaM.,NakazawaM.,MizutaniM.andKikuchiT.PathologicalstudyofJapanesequailembryowithacidαglucosidasedeficiencyduringearlydevelopment.ActaNeuropathol.92,249･254,1996.6)KunitaR.,Nakabayashi0.,WuJ.lY.,HagiwaraY.,MizutaniM.,PennybackerM.F.,ChenY.-T.andEikuchiT.MolecularclonilgOfacidα-glucosidasecI)NAsofJapanesequail(Coturnixcoturnixjaponica)andthelackofitsnRNAinacidmaltasedeficientqlails.Biochem.Biophys.Acta.1362,2691278,1997.7)EikuchiT.,YangH.W.,PennybackerM.,IchiharaN.,MizutaniM.,VanHoveJ.LK.andChenY.IT.Clinicaland皿etaboliccorrectionofPompediseasebyenzy皿etherapyinacidmaltase-deficientquail.J.Clin.Invest.101,827-833,1998.8)BijvoetA.G.A.,VandeRampE.H.M.,KroosM.A.,I)ingJ.-H.,YangB.Z.,VisserP.,BakkerC.E.,VerbeetM.P.,OostralB.A.,RouserA.J.∫.andvanderPloegA.T.GeneralizedglycogenstorageandcardionegalyinaknockoutmousemodelofPompedisease.Hl皿.Mol.Genet.7,53-62,1998.9)vanHoveJ.L K.,YangH.W.,WuJ.-Y.,BradyR.0.andChenY.-T.High levelproductionofrecombinanthumanlysosomalacida-glucosidaseinChinesehamsterovarycellswhichtargetstoheartmuscleandcorrectsglycogenacclnulationinfibroblastsfrompatientswithPo皿pedisease.Proc.Natl.Acad.S°i.USA.93,65-70,1996.10)BartonN.W.,FurbishF.S.,MurrayG.∫.,GarfieldM.andBradyR.0.TherapeuticresponsetointravenolSinflSionsofglucocerebrosidaseinapatientwithGaucherdisease.Proc.Natl.Acad.S°i.USA.87,1913-1916,1990.ll)Yangn.W.,MizutaniM.,IlagiwaraY.,KikuchiT.,VanHoveJ.L E.andChenY.一T.Recombinanthl皿anacida-glucosidasecorrectsacida-glucosidasedeficientht皿anfibroblasts,quailfibroblastsandquailmyoblasts.PediatricRes.43,374-380,1998.

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