Saigusa, Masayuki

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13寄 稿ビタミンB12欠乏ラットの飼育河田 哲典1)･山田 和弘2)･和田 政裕2)･田所 忠弘2)･前川 昭男2)1)岡山大学教育学部 2)東京農業大学農学部は じめ にビタミンB12(B12)は高等動物において,葉酸代謝,メチオニン代謝に関与するメチオニンシンターゼ (Metsynthase)並びにバリン,イソロイシン等のアミノ酸,プロピオン酸代謝経路の最終段階であるメチルマロニルCoAムターゼ(MMCoAmutase)の補酵素として機能することが知られている1･2).B12依存性酵素の関与する反応を図-1に示した｡現在,ビタミンB12の研究は補酵素機能の酵素化学的解明,吸収及び生体内輸送機構,欠乏症の生理学的研究及びB12の臨床応用等多岐にわたっているが,B12研究の課題の一つとしてB12の酵素化学的研究の成果と欠乏症発現との関連性の解明が指摘されている3)｡すなわちB12依存性酵素活性の低下に起因する二次的代謝変動の詳細については未だ検討の余地が多く残されており,従来判明しているB12が関与する酵素反応のみでは十分説明できない代謝変動の報告も見られる｡これらB12欠乏症の発現機序並びにB12の作用機序の解明には当然のことながらB12欠乏モデルアニマルが極めて有用である｡著者らは現在までに明確なB12欠乏状態のラットを飼育し,B12欠乏により惹起される代謝変動の一端を報告した4~9)｡今回は現在までに著者らが得ているB12欠乏ラットの基礎成績を紹介する｡実験動物及び飼料粗成B12の研究に用いられる実験動物はラット10~11)が最も多く,-ムスター12)の報告も見られる｡またサル 13), ヒヒ14),コウモリ15)はB12欠乏時に神経障害が発現することから,ヒトのB 12欠乏神経障害のアニマルモデルとして使用されている｡ またニワトリ16),ウズラ17)等の家禽の成績も報告されている｡しかしラットを用いた場合,B12の生物学的半減期は長く,B12欠乏ラットの飼育は長期間を要する｡更にラットは糞食傾向にあること18),B12欠乏精製飼料の調製19)及び飼育には厳密な管理が必要であること20)等が指摘されている｡ これらの理由から,明確なB12欠乏状態のラットの飼育は困難とされており18),B12研究の陸路の一つとなっている｡著者らは妊娠,授乳期間を通しB12欠乏飼料を給与した親ラットから出生,離乳したWistar系ラットを用い,B12の胎盤通過の影響をできるだけ少SH〔ト)IHIM-C-HICOOHメチオニン??? ?? ?叩ご〉=X=NN? ? ??? ??? ?? 0 ⊂00H?? ?????メチオニンシンターゼ(書目.)I "INFIH"lfHI…-C-HCOOHホモシステインCOSCoAJ1-C-Cli)CO)LiメチルマロニルCoA?0 cooH?????テ トラヒドロ葉酸1~?? ???? ??? ??-(cH.〕rcooHCOSCoA【CIi】-CHlCOlHサクシニルCoAメチルマロニルCoAムターゼ図 1 高等動物におけるビタミンB12依存性酵素14表1 ビタミンB12欠乏飼料ダイズタンパク質飼料分能ダイズタンパク質*1無水グルコースラー ド無機塩混合*2ビタミン混合*2塩化コリン(g/100g飼料)18.066.610.05.00.250.15カゼイン飼料精製カゼイン無水グルコースラー ド無機塩混合ビタミン混合塩化コリン(g/100g飼料)18.066.610.05.00.250.15*1 市販分離ダイズタンパク質,タンパク質85%*2 Harpar,A.E.,∫.Nutr.,68,405(1959)??? ? ? ??? ???? ????????? ? ? ???????? ? ??? ? ?ESi( o/口,-D-ロロ/_〇一0-0? ? ? ?? ? ? ?50100 (日)図2 ビタミンB12欠乏ラットの成長(各値は5例の平均)ダイズタンパク質飼料 カゼイン飼料○- o B12給与 ロ- C B12給与●-●B12欠乏 IL-■B12欠乏なくした20)｡またラットの飼育は厳密な飼育管理下で行った｡すなわち微量のB12の汚染を避けるため,他の栄養実験のラット並びに飼料から隔離,菜食のリスクを低下させるため,清潔な綱目の荒い金網底のステンレスケージでラットを飼育した20)｡B12欠乏飼料の組成は研究者によって異なっている｡ 飼料タンパク質として栄養価の高いカゼインを用いた報告11,21･22)も見られるが,市販カゼインはB12を含むのでカゼインを熱エタノールで処理し,B12フリー にする必要がある｡また市販されている?〔???? ???? ?????? ? ? ?? ? ? ‖ ? 〓 ? ??? ?ー ? ?? ? ?ー ? ? ? ?? ?? ? ? ー ? ? ?30 6090 用 ) 120図3 ビタミンB12欠乏ラットの尿中メチルマロン酸排推量(各値は5例の平均値±標準偏差)●-●ダイズタンパ ク質飼料■-■カゼイン飼料ビタミンフリー カゼインも微量のB12が含まれている｡最近のB12欠乏実験は欠乏飼料の調製が容易なことから,分離ダイズタンパク質を用いた飼料が多い10･23,24)｡更にアミノ酸混合を用いた報告も見られる25)O著者らはダイズタンパク質及びB12フリーカゼインをタンパク質源とした2種のB12無添加飼料を用い,B12欠乏ラットを飼育した｡B12無添加飼料の組成を表-1に示した｡ビタミンB 12欠乏ラットの成長B12欠乏ラットの成長は遅延することが広く知られている｡Fehlingら19)は48週間飼育したB12欠乏ラットの体重は対照の約67%を示し,Frenkelら11)は13週で80%であったと報告 している｡ 同様にBrinkら10)は0.5%DLMet添加20%ダイズタンパク質B12欠乏飼料で39週間飼育したラットの成長は対照の約77%を示すことを報告している｡Brinkらm)はこのラットの肝臓B12レベルは12.3±0.4ng/gであり,骨髄及び末梢血液血液像の変化が認められることから,重篤なBl:2欠乏状態であることを確認している｡著者らはダイズタンパク質及びカゼイン飼料でB12欠乏ラットを140日間飼育したところ,ラットの成長は対照のそれぞれ約52%,55%といずれも15顕著な遅延が認められた｡またB12欠乏ラットの飼育期間中の飼料摂取量のみならず飼料効率の低下も認めている｡B12欠乏ラットの成長を図-2に示した｡最近著者らはpair-feedingで90日間飼育したB12欠乏ラットにおいても成長は遅延し,タンパク質栄養状態の指標となる血柴タンパク質レベル,尿中アラントイン,肝臓キサンチンオキシダーゼ活性が低下することを認めている26)｡この成績はB12欠乏により飼料タンパク質の利用が低下することを示 し,飼料 タンパ ク質の利用低下 は Metsynthase活性の低下による Metavailability低下に起因するものと考えられる｡ビタミンB12欠乏ラットの尿中メチルマロン酸排雅量140日間の飼育中におけるB12欠乏ラットの尿中メチルマロン酸(MMA)排推量を図-3に示した.ダイズタンパク質飼料,カゼイン飼料 ともに顕著な増加が認められた｡B12欠乏時の尿中MMA排雅量の増加はMMCoAmutase活性低下によるメチルマロニル CoAからサクシニル CoAへの転換の障害に起因する(図-1)0Brinkら10)は飼育40週の飼育期間中におけるB12欠乏ラットの尿中MMA排推量は直線的に増加し,肝臓B12レベルの低下と相関することを報告している｡Reedら22)は肝臓 MMCoAmutase活性の低下が著しい場令,尿中 MMA 排推量の増加が顕著であり,MMCoAmutase活性が対照の50%に低下すると尿中 MMA 排推量は1.5〟mol/24日/g体重以上に増加することを報告した｡更にFrenkelら27)はB12欠乏ラットの肝臓B12レベルが約30ng/g肝臓以下に低下すると肝臓 MMCoA レベルの急激な増加が見られることを示した｡このように尿中MMA排推量はB12欠乏状態の有力な判定指標となり,しかもラットを屠殺せずに欠乏状態が判定できることから広 く測定されている｡しかしB12欠乏ラットの尿中 MMA 排推量は飼料組成28-31),飼料-のMMA前駆体の添加18),絶食18)等飼育条件によって影響されることも報告されている｡ビタミンB12欠乏ラットの臓器ビタミンB12レベルB12欠乏ラットの臓器B12レベルを図-4に示し5Dも 1000=Nロ〕5bDiPbβ†■JEEQ 10脳 心臓 腎臓 肝臓 牌臓 皐丸図4 ビタミンB 12欠乏ラットの臓器ビタミンB 12レベル(各値は5例の平均値±標準偏差)表2 ビタミンB .2欠乏ラットの肝臓ビタミンB 12依存性酵素の活性Metンンターゼ* MMCoAム タ-ゼ*pmol/mgタンパク質 nmol/g肝臓 pmol/Tngタンパク質 nmol/g肝臓B12給与 182.6土23.9 8.69=0,53 194.1±25.6 28.39±1.50B12欠乏 9.2± 1.6 0.34工0.06 10.8± 4.3 1,34±0.54*各値は5例の平均値r標準偏差た｡いずれの臓器もB12レベルの著しい低下が認められた｡ラットの臓器B12量に関する報告は多い｡特にB12給与ラットでは腎臓B12量が高いことはよく知られ32~34),生体内のB12の貯蔵,代謝における腎臓の機能についてもよく知 られている35,36)0Dryden ら37)は189-301日飼育したラットの臓器B12レベルを測定し,B12給与ラットでは腎臓が最も高値であり,脳下垂体,副腎,心臓が肝臓,牌臓,厚顔等に比べ高値を示すことを報告している｡またB12欠乏ラットでは心臓19± 3ng,肝臓11±2ng,牌臓17±2ng,腎臓69±12ng及び葦丸5± 116ng/g臓器に低下することを認めている｡またBrinkらlo)は44週のB12欠乏で肝臓B12レベルは7.9±2.8ng/g臓器に低下すると報告 している｡著者実験ではダイズタンパク質飼料,カゼイン飼料 ともにこれらの報告に比べ低 レベルを示 した｡ビタミンB12欠乏ラットの肝臓 B 12依存性酵素活性ダイズタンパク質飼料で飼育 したB12欠乏ラットの肝臓B12依存性酵素活性を表-2に示 した｡肝臓MMCoA mutase活性はB12無給与により対照の約 5% と顕著な低下を示 した｡B12欠乏ラットの尿中MMA排推量の顕著な増加はMMCoAmutase活性の著しい低下からも支持される｡また肝臓 Metsyn仙ase活性 も対照の約 5%に低下することが認められた｡B12欠乏時の Metsynthase活性並びにその活性変動の影響 を評価することはB12と葉酸,メチオニン代謝の関連性 を解明するうえで重要である｡ B12欠乏ラットの肝臓 Metsynthase活性の報告は多く見られる22,38)｡Scottら36)は肝臓B12レベルが25-66ng/g肝臓を示す軽度なB12欠乏ラットの肝臓,腎臓 MMCoAmutase活性はアポ酵秦,ホロ酵素 ともに低下するが,Metsynthase活性の変動は見られないと報告 している｡これはB12欠乏初期では両酵素タンパク質の挙動が異なることを示す とともに MMCoA mutase は Metsynthaseに比べ早期に活性低下を起こす可能性を示唆したものと考えられる｡一方,近年 N20ガスが Cob(Ⅰ)alamin を不活性化 し,Metsynthase活性 を低下させ ることが明らかにされている39,40)0 Kondo ら41)は N20ガス暴露ラットの Metsynthase活性は N20ガス暴露により約15%にまで低下することを報告 した｡このことからN20ガス暴露ラットは実験的B12欠乏モデルとして用いられ,B12と葉酸,メチオニン代謝 との関連の追究が進められている｡著者らのB12欠乏ラットではB12依存性酵素活性が極めて低値 を示 したことからB12欠乏症の発現機序,並びにB12の作用機序の解明のモデルアニマルとなり得ることが示唆された｡文 献1)Taylor,R.T∴B12(Dolphin,D.,ed.),Vo12,p.307-356(AWiley-1ntersciencePublication,NewYork)(1982).2)Retey,J∴B12(Dolphin,D.,ed.),Vo12,p.357-380(A Wiley･IntersciencePublication,New York)(1982).3)森下玲児 ･内野治人 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瀬戸内の森と林―自然林の生育とその生態的機能を考える―

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