Onishi, Toshiyuki

Ono, Koichi

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実験動物とワクチンの品質管理―日本脳炎ワクチン力価試験用マウスの検討―

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8実験動物とワクチンの品質管理一日本脳炎ワクチン力価試験用マウスの検討-小 野 耕 一 ･ 大 西 敏 之財団法人阪大微生物病研究会観音寺研究所Eヨ 言日本脳炎ワクチンの有効性試験 (以下力価試験)は､1974年 (1973年厚生省告示)よりワクチンをマウスに接種 (以下免疫)し､産生する中和抗体価を測定する方法で試験されている｡動物試験は､動物の種類､系統､性別､交配方法､週令､さらに､その飼育環境等が試験成境に影響する事はよく言われている｡特に最近の科学の進歩と共に動物試験においては高精度でかつ再現性の高い試験が要求されており､日本脳炎ワクチンの力価試験もマウスを使用する為､それらの影響を十分考慮する必要がある｡当会では､この試験にddY系4週令の雌マウスを使用 している｡ このddY系マウスの由来は､1890年～1920年頃､ドイツからある研究者が日本に持ち帰ったマウスを1944年頃東京大学伝染病研究所 (現在の医科学研究所)が入手し､クローズドコロニーとして維持生産し全国の研究所に提供していた｡ 1963年現在の実験動物生産メーカーである日本SLC株式会社が､国立予防衛生研究所より分1.免疫血清の作成1)マウスの準備マウス:4週令 雌マウス使用数 :10匹以上/1検体2)参照日本脳炎ワクチン及び試験検体の希釈ワクチン希釈 :32倍3)免疫と採血免疫方法 :0.5ml/マウス腹腔内免疫スケtlJ.i-ル第1回免疫 (0日目)第2回免疫 (7日目)4)採血個別採血 (14日日)5)血清分離個別に分離後等量プール6)血清処理血清の非働化 :56℃で30分間与を受け維持生産したものである｡ 過去､国立予防衛生研究所およびほとんどのワクチンメーカーにおいて 日本 SLC株式会社の､クリーンマウス(Std ddY 通称No.28マウス)を使用していた｡しかし最近動物施設のグレードアップ等により､SPFマウスを使用する動きがある｡ 今回我々は､同じクローズドコロニーのddYで､飼育環境の異なる､SPFマウス (SIc:ddY 通称引佐マウス)と従来のクリーンマウスについて日本脳炎ワクチンに対する免疫応答を比較したので報告する｡方 法日本脳炎ワクチンのマウスに対する免疫応答を比較する方法として､図1に示した厚生省薬務局監修生物学的製剤基準 (以下基準)の日本脳炎ワクチンの力価試験の方法に従ったが､一部本実験の目的により変更した下記の方法で実施した｡2.中和試験1)ニワトリ胎児細胞の作製培養用容器 :直径7cmシャーレ培養条件 :36℃,5%炭酸ガス培養器内で一夜2)血清希釈3)攻撃ウイルスの希釈 :最終100PFU/シャーレ4)中和反応陽性対照 :(攻撃ウイルス1ml:希釈液1ml)検体 :(攻撃ウイルス1ml:希釈検体1ml)反応条件 :36℃ ,90分間反応5)反応停止 :氷水中6)接種 :0.4m l/シャーレ7)吸着 :36℃ ,5%炭酸ガス培養器内で90分間8)第 1次重層寒天培地 (8m l/シャーレ)9)培養 :36℃ ,5%炭酸ガス培養器内で3日間10)第2次重層寒天培地 (4m l/シャーレ)11)ブラックカウント12)中和抗体価の算出陽性対照のブラック数と比較したとき50%減少させる血清の希釈率を中和抗体価とする3.力価試験の判定試験検体の力価 (中和抗体価)は､参照日本脳炎ワクチンの力価と同等以上でなければならない図1.日本脳炎ワクチンの力価試験方法9???? ? ????10 15マウス数/検体図2.個別及びプール血清の中和抗体価No.28マウス ○ □(平均値)引佐マウス ●1.使用マウス1)日本SLC株式会社､Std ddY､4週令､クリーン雌マウス (以下No.28マウス)2)日本SLC株式会社､SIc:ddY､4過令､SPF雌マウス (以下引佐マウス)2.使用ワクチン国立予防衛生研究所より分与を受けた参照日本脳炎ワクチン中山株 Lot181(以下ワクチン)3.定性的比較No.28および引佐マウスそれぞれ90匹に､32倍希釈したワクチンを基準に従い免疫した｡第2回免疫の7日後に､個別に採血を行い､血清分離後､血清検体から無作為に抽出した個別血清10検体と10匹､15匹および30匹のプール血清各3検体および90匹のプール血清 1検体について基準に従い中和抗体価を測定した｡この実験は､3回の異なった入荷日のマウスについて実施した｡得られた血清の中和抗体価について両マウス間の分散値と平均値の有意差検定を行った｡4.定量的比較8倍､16倍､32倍および64倍に希釈 したワクチンを､各々の希釈につきNo.28マウスと引佐マウス各30匹に免疫 した｡個別に探血を行い､血清分離後､血清検体を各希釈毎に無作為に2等分し15匹プール血清を2検体作製した｡この実験も上記同様3回の異なった入荷日のマウスについて実施した｡30雷(平均値)両マウスから得られた血清の中和抗体価の用量反応回帰について､平行線定量法により直線性､平行性および抗体産生能の差 (相対力価)を算出した｡結 果1.定性的比較個別血清とプール血清の入荷3回分の中和抗体価測定成境を表 1および図2に示した｡図2の個別血清の央印の2検体について入荷別に異常値の棄却検定をした結果､異常値 (p<0.05)と判定され､この図の平均値および以下の検定から削除した｡個別血清および各プール血清別に両マウス間の分散の一棟性を検定した結果､10匹､15匹､30匹および90匹のプール血清においては有意差を認めなかった｡しかし､個別血清では有意差(p<0.05)が認めれた｡平均値については､分散の一棟性が否定された個別血清は不等分散を､分散の一棟性に有意差を認めなかった各プール血清は､等分散を仮定し検定した｡15匹､30匹､及び90匹のプール血清では､両マウス間の平均値に有意差を認めなかった｡ しか し10匹プール血清は (p<0.05)で､個別血清は(p<0.01)で平均値に有意差が認められ､それぞれ引佐マウスの中和抗体価の平均値が高値であった｡入荷別の中和抗体価とその分散値を図3および図4に示した｡図3の央印の検体は､先の異常値の検定で削除した検体で､図3の平均値および図4の分散値には含まれていないQ図3についてNo.28マウスの個別血清で､入荷 1と入荷2に比べ入荷3の中和抗体価のばらつきが大きかった｡ また10匹プ-10表1 個別血清とプール血清の中和抗体価1)個別血清A群 (No.28マウス) B群 (引佐マウス)血清番号 入荷1 入荷2 入荷3 血清番号 入荷1 入荷2 入荷31 1.97 2.73 3.00 1 3.46 3.36 2.812 1.48 1.91 2.42 2 2.52 2.23 2.063 2.78 1.83 1.89 3 2.51 2.70 2.414 1.61 2.79 0.98 4 1,97 2.52 2_Ol5 1.51 1.76 2.94 5 2,93 2.18 2.226 1.62 0.49 1.31 6 1,50 2.73 3.ll7 3.07 2.45 0.75 7 2.46 2.50 3.058 1.77 2.59 1.49 8 2.10 1.57 2.239 3.18 1.63 2.08 9 3.14 2.52 2.4110 2.12 2.71 0.84 10 1.71 2.23 0.46平均値 1,99 平均値 2.39最大値 3.18 最大値 3.46最 小値 0.49 最小値 0.46棲準偏差 0.7312 標準偏差 0.60692)10匹プール血清A群 (No.28マウス) B群 (引佐マウス)血清番号 入荷 1 入荷2 入荷3 血清番号 入荷1 入荷2 入 口31 2.70 2.13 2.34 1 2.75 2.55 2.792 2.89 2.20 2.34 2 2.32 2.81 2.733 2.02 2.65 2.08 3 2.68 2.60 3,02平均値 2.37 平均値 2.69最大値 2.89 最大値 3.02最小値 2.02 最小値 2.32棲 準 偏 ■差 0.3067 標準偏差 0.19463)15匹プール血清A群 (No.28マウス) B群 (引佐マウス)血清番号 入荷1 入荷2 入荷3 血清番号 入荷1 入荷2 入荷31 2.38 2.31 2.61 1 2.64 2.59 2.772 2.85 2.49 2.61 2 2.39 2.77 2.683 2.80 2.90 2.41 3 2.51 2.42 3.03平均値 2.60 平均値 2.64最大値 2.90 最大値 3.03最小値 2.31 最小値 2.39棲 準 偏 差 0.216 標準偏差 0.19934)30匹プール血清A群 (No.28マウス) B群 (引佐マウス)血清番号 入荷 1 入荷2 入荷3 血清番号 入荷1 入荷2 入荷31 3.04 2.14 2.65 1 3.00 2.64 2.692 2.64 2.50 2.91 2 2.57 2.89 2.843 2.72 3.06 2.85 3 2.71 2.57 3.02平均値 2.72 平均値 2.77最大値 3.06 最大値 3.02最小値 2.14 最小値 2.57標準偏差 0.2887 標準偏差 0.17385)90匹プール血清A群 (No.28マウス) B群 (引佐マウス)血清番号 入荷 1 入荷2 入荷3 血清番号 入荷1 入荷2 入 口31 2.87 2.93 2.74 1 2.71 2.88 2.84平均値 2.85 平均値 2.81最大値 2.93 最大値 2.88最小値 2.74 最小値 2.71ll?????? ? ? ?????? ??入荷??????? ?????????? ????????????』? ? ????? ??? ?? ?????? ???号123123123123123?????? ? ? ??? ??????????????????????????? ???? ??? ???? 》IO1231231231231231 10 15 30 90 1 10 15 30 90マウス数/検体図3.個別､プール血清の入荷別中和抗体価○血清検体 ■平均値10 15マウス数/検体30図4.個別及びプール血清の分散借No.28:○入荷別 口--全体引 佐 :●入荷別 ■一一･全体0.812??????? ??? ??LoglO?????? ??16 32 64倍ワクチン希釈図5. 日本脳炎ワクチンに対する用量反応No.28:○--引 佐:●-? ??? ? ??? ?? ?? ??? ??? ? ? ???? ???????⊂]平均値N=50No.28???〓? ??? ? ? ? ??? ? ? ? ? ??? ? ? ? ? ? ? ???}平均値N=30? ??1983 191 1993図6.個別血清の中和抗体価の年次変化199313ル血清と30匹プール血清にも同様に入荷別の差がみられ､10匹プール血清では入荷 1､30匹プール血清では入荷2のばらつきが大きかった｡引佐マウスについては､入荷別の平均抗体価にはやや差があるが､No.28マウスに比べばらつきが小さく､10匹以上のプール血清ではほを均 一なばらつきである｡図4の分散値について､No.28マウスに示された数字は入荷番号で､個別血清では入荷3､10匹プール血清では入荷1､30匹プール血清では入荷2の分散値が他の入荷グループと比べ高いようであったが､分散値の統計学的有意差は認められなかった｡引佐マウスは10匹以上のプール血清ではほぼ均一で低い分散値であった｡2.定量的比較日本脳炎ワクチンに対する両マウスでの用量反応を表2および図5に示した｡図5に示した直線は､最小自乗法により求めた両マウスの回帰直線でほぼ同一線上にあった｡分散分析の結果､両マウスの回帰直線の直線性と平行性に有意差を認めなかった｡しかし､全検体における両マウスの分散の一棟性は否定され特に用量32倍と64倍では両マウスのばらつきの差が大きくNo.28マウスの方がばらついていた｡32倍と64倍の各用量についてのみ､さらに分散の一様性を検定したところ､32倍では､有意差(p>0.05)があったが､64倍では､検定統計量としての分散比のとる確率p-0.064で危険率5%では､有意差なしであった｡分散の一棟性の問題があるため相対力価の信頼性は低いが､No.28マウスに対する引佐マウスの相対力価は､0.98(95%信頼区間は0.69-1.38)で両マウス間に差は認められなかった｡考 察以上の結果､同じddYで飼育環境が異なり微生物学的品質に差があると考えられる両マウスについて私たちが行った実験では､15匹以上のマウスを使用すれば日本脳炎ワクチンに対する平均抗体価および用量反応に有意差がなかった｡しかし実際にワクチンの検定を行う上での技術的な問題としては､最近のNo.28マウスは分散値が大きく､分散値が少なくまた分散値が一定している引佐マウスが優れていると考える｡No.28マウスの中和抗体価のばらつきの原因として､入荷別のばらつきに差があると考えられるが､個別血清では入荷3､10匹プール血清では入荷 1､30匹プール血清では入荷2の分散値が大きいことを考えると､入荷別と言うよりNo.28マウス自体のばらつきであるとも考えられる｡今回の実験は､飼育環境のみ異なることを前提に進めた実験であるが､分散値の差が飼育環境だけによるものか､その他交配方法による遺伝的なものかさ表2 日本脳炎ワクチンに対する用量反応試験成績マウス群 入荷番号 ワクチン希釈8倍 16倍 32倍 64倍No.28マウス 1 3.29 2_96 2.59 1.823.44 2.51 3.01 1.322 3.28 2.97 2_83 2.66282 8 3.09 73 3.1 3.07 2.24 1.224 269 02 209平均 3.178 2.833 2_63 1.968分散 0.04546 0.04339 0.18436 0.40618回帰式 y=-1.273x+4.378引佐マウス 1 2.89 2.64 2.45 2_213.33 2.87 2.53 2.322 3.22 2.91 2.66 1.6446 32 4 _553 2.98 3.12 2.8 1_92327 294 67 .5平均 3.192 2.948 2.585 1.932分散 0.04678 0.04014 0.02291 0.091914らに考察してみた｡図6は､今回実施した1993年の､No.28マウスと引佐マウスに加えて､1983年および1991年のNo.28マウスの個別血清の中和抗体価を示した｡実験に使用したワクチンは､今回と同様全て参照日本脳炎ワクチンLot181である｡ 1983年のNo.28マウスと今回の引佐マウスは､分布がよく似ており､また分散も有意差がなかったが､1991年と1993年の成境では､それらと異なり中和抗体価が1.0を下回る検体が多数認められた｡1983年前後の成境および1983年以後8年間の成勅 書ない為､断定することは出来ないが､No.28マウスの性状に変化があったのではないかと推測される｡ またNo.28マウスと引佐マウスの生産方法を考えた場合､両マウスともに種親になるマウスは､SPFマウスで6群間循環交配方式によるオス1メス1の常時同居交配であり､さらに生産集団の交配方法もオス1メス3方式で同じである｡これらのことを考慮すると､今回の分散借の違いの原因は一過性であることが考えられ､今後長期にわたる経時的な検討が必要である｡ しかし､今回の実験結果では飼育環境が異なるとこのような違いが出る可能性がある事は否定できず飼育環境は検定を行う上での重要な要因である事が再認識された｡ 最後に､今回の実験に使用したワクチンは､1987年以前のワクチン株で､現在当会が輸出用として製造している中山株ワクチンであるが､現在国内で使用されているワクチン株である北京株についても今後同様に検討していきたいと考えている｡

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