Hata, Masaki

Okayama University Scientific Achievement Repository

論 文 要 旨 等 報 告 書  氏  名 秦 正 樹  授与した学位 博  専攻分野の名称 歯  学位授与の番号 博  乙   第 4 2 3  ?????学位授与の日付 平 成 2 0 年 3 月 2 5 日  学位授与の要件 博士の学位論文提出者（学位規則第4条第2項該当）  学位論文題名 エナメル芽細胞におけるタイトジャンクションの免疫組織化学的研究  －オクルディンおよびクローディンの発現パターンー  論文審査委員 教授 吉山 昌宏 准教授 長塚 仁教授 山本 敏男  学 位 論 文 内 容 の 要 旨   タイトジャンクション（TJ）は上皮細胞間の／くリア構造であり，細胞間隙の輸送制御に機能す  r  る。TJを構成するタンパクとしてはオクルディン（OLD）とクローディン（CLD）が知られて  いる。OLDは上皮細胞のTJに普遍的に存在する。他方，CLDは24種類存在し，TJにおける  CLDの発現は組織、細胞特異的であることが報告されており、上皮細胞間輸送ならびに細胞機  能と密接に関連することが示唆されている。口腔粘膜上皮から分化したエナメル芽細胞はエナメ  ル質形成を行う。エナメル芽細胞におけるTJの存在は凍結レプリカ法により報告されており、  エナメル質形成においてエナメル芽細胞層を介した溶質およびミネラル輸送にTJは重要な役割  を果たすと考えられている。 しかしながら，エナメル芽細胞における形成期，成熟期におけるそ  れぞれのTJの分布や構成タンパクについてはよく分かっていない。   本研究はエナメル芽細胞層を介する輸送機構とTJについて着目し，マウス切歯を用いてOLD  ならびにCLDの発現を免疫組織化学的に調べた。   材料と方法   実験動物は5・6週齢のマウス（C57BL6／J）を用いた。麻酔後断頭屠殺し，マウス頭部をただ  ちに液体窒素で冷却したイソペンタンで凍結して5％carboxym占thylce11uloseに包埋した。  OLDならびにCLDの免疫組織化学的検出に際しては未固定未脱灰凍結切片を用いた。切片の作  製にあたっては凍結フイルム法を用い，約5〃mの未脱灰切歯の凍結切片を作製した。一部の動  物については凍結切片下で成熟期エナメル芽細胞のrume・endedameloblast（R・A）と  smooth・endedameloblast（S・A）を区別するために0．04％カルセイン水溶液を麻酔下で心臓に注  射し，10min後に頭部を採取した。免疫組織化学は、切歯凍結切片を95％エタノールで・20℃  30min浸漬後．引き続き100％アセトンで1min室温固定した。一次抗体として抗OLDモノク  ロナール抗体および抗CLD・1からCLD・10までのポリタロナール抗体10種類を用いた。   一次抗体の反応は室温で4時間行った。二次抗体はCy3で標識された抗体を用い，室温i  で1時間反応を行った後，位相差像ならびに蛍光像を観察した。  結果ならびに考察   観察に際しては形成期エナメル芽細胞と成熟期エナメル芽細胞について行い，成熟期について  はさらにru皿e・endedameloblast（R・A）とsmooth・endedameloblast（S・A）に分けて観察し  ′  た。  形成期エナメル芽細胞では遠心端にOLDとCLD・1，8と9が発現していた。他のCLD種，す  なわちCLD・2．・3，・4，・5，・6，・7，および・10は反応が認められなかった。成熟期エナメル芽  細胞ではOLDとCLD・1，・6，ワ，－8，・9，および・10が陽性反応を呈しており，形成期には発現  が認められなかったCLD・6，・7と・10が新たに発現していた。形成期ならびに成熟期についての  OLDならびにCLD穫の発現についての報告はなく，本研究によって初めて示されたものである。   成熟期エナメル芽細胞ではOLDと形成期に認められたCLD種に加えてCLD・6，・7および・10  があらたに発現していることについては，成熟期エナメル芽細胞の機能がエナメルタンパクの分  解・脱却，水分の脱却ならびにカルシウム等のミネラル輸送であることからCLD・6，ワ，・10は  これらの輸送に関与すると考えられた。   成熟期のOLDとCLD種の陽性反応は特徴的な局在を呈していた。すなわち，OLDの蛍光は  近心端と遠心端の両端にみられ，二本の平行線を呈するように陽性反応が認められた。  一般に上皮細胞におけるTJは細胞の頂部領域に存在するが，成熟期エナメル芽細胞では頂部領  域と基底側の2箇所にみられ，他の上皮細胞にはみられない特異な分布をすることが明らかにな  った。これらのTJ局在は成熟期における活発な物質輸送の制御ならびに，細胞の近遠心側に基  底膜が欠如することに関連するものと考えられた。   成熟期エナメル芽細胞のR・AとS・Aは機能的差異があることが知られているので，OLD，C  の発現パターンについてカルセイン投与によりR・A領域とS・A領域を識別して観察したが，  に差異がないことが明らかになった。また，発現パターンについて差異が認められないのは，  AとS・Aが周期的且つ相互に移行するためと推察された。   論文審査結果の要 旨   タイトジャンクション（TJ）は上皮細胞間のバリア構造であり，細胞間隙の輸送制  御に機能する。TJを構成するタンパクとしてはオクルディン（OLD）とクローディ  ン（CLD）が知られている。 OLDは上皮細胞のTJに普遍的に存在が，他方CLDは  ■■ 24種類存在し，その発琴は組織、細胞特異的であり，且つ上皮細胞間輸送ならびに細  胞機能と密接に関連することが示唆されている。エナメル芽細胞は口腔粘膜上皮から  分化し，エナメル質形成に際してエナメルタン／くクやミネラル輸送を活発に行い，こ  れらの輸送にTJは重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら，エナメル  芽細胞の形成期，成熟期におけるそれぞれのTJの分布や構成タンパク，特にCLD種  についてはよく分かっていない。   本研究はエナメル芽細胞層を介する輸送機構とTJにつ 用い，形成期ならびに成熟期エナメル芽細胞のOLDならびにCLDの発現を免疫組織  化学的に追求したものである。その結果，形成期エナメル芽細胞では遠心端にOLD  とCLD－1，8と9が発現していた。他方，成熟期エナメル芽細胞ではOLDとCLD－1，  －6，－7，－8，・9，および・10が陽性反応を呈しており，形成期には発現が認められなか  ったCLD・6，・7と・10が新たに発現していた。成熟期のこれらOLDとCLDの陽性反  応は特徴的な局在を呈しており，すなわち近心端と遠心端の両端に局在性が認められ  た。これらの発現パターンをカルセイン投与により ru皿e・ended ameloblast領域と  smooth・endeda皿eloblast領域を識別して観察すると，両者に差異は認められなかっ  た。   以上の結果から，エナメル芽細胞に発現する CLDのタイプが初めて示され，形成  期と成熟期エナメル芽細胞で発現するCLDのタイプが異なっていることが明らかと  なった。また，従来の所見とは異なり，成熟期エナメル芽細胞では近遠心両端にTJ  が存在することが示された。さらに形成期と成熟期エナメル芽細胞で発現するCLDのi  タイプが異なっていることが明らかとなった。これらの所見はエナメル質形成におい  て，ミネラルを始めとするエナメル芽細胞層を介する物質輸送の機構を解明するうえ  で新たな視点を与える重要なものと考えられる。したがって，審査員一同本論文は博  士（歯学）の学位論文として価値あるものと認めた。   

エナメル芽細胞におけるタイトジャンクションの免疫組織化学的研究　－オクルディンおよびクローディンの発現パターン－

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