Murata, Hiromi

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単球におけるＬＰＳ誘導性の新規ＴＮＦ-α転写制御因子に関する研究

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論文要 旨 等報告書  氏  村 田 裕 美  授与した学位 博  専攻分野の名称 歯  学位授与の番号 博  甲  士  第 3 7 2 4 号  学位授与の日付 平 成 2 0 年 9 月 3 0 日  学位授与の要件 医歯学総合研究科病態制御科学専攻（学位規則第4条第1項該当）  学位論文題名 単球におけるLPS誘導性の新規TNF－α転写制御因子に関する研究  論文審査委員 教授滝川正春教授高柴正悟准教授苔口 進  学 位論 文 内 容 の 要 旨   【緒旨】   単球が1ipopolysaccharide（LPS）の刺激を受けて産生する炎症性サイトカインtumornecrosis  factor－alpha（TNF－α）は，生体における最も主要で強力な炎症性メディェ一夕ーである。抗腫瘍   作用や正常な免疫反応を担う一方で，過剰に産生されると，慢性関節性リウマチやクローン病，   多発性硬化症，そして歯周病などの，多くの自己免疫疾患や炎症性疾患の病因にもなる。従っ   て，m－αの産生は非常に厳密に調節されている必要があり，その産生メカニズムを解明するこ   とは，歯周病を含む炎症性疾患の治療を考える上で非常に重要な課題である。  【目的】   mF－αの転写因子としてNF－kBが広く知られているが，強いプロモーター活性を示したTNトⅥ   プロモーター領域（T550～－487）に，NF－KBに加えてLPS誘導性の未知のタンパクが複数結   合する可能性が示唆された。この事実に基づき，同プロモーター領域からNF－KBの結合部位を   除いた領域に結合するDNA結合性タンパクを，LPS刺激した単球のcDNAライブラリーを用い   た酵母one－hybrid法により検索し，単球におけるLPS誘導性の新規のTN下－α転写制御因子を同   定することを目的とした。  【材料および方法】  1．細胞培養と刺激：ヒト単球系細胞株THP－1細胞を，10％のウシ胎児血清を含むRpMI1640培   地で培養した。細胞の刺激は，200nMのphorbol12－myristate13－aCetate（PMA）を含む   macrophage－SFMで24時間培養し分化させた後に，LPSを100ng／mlの濃度に含む上述の培地   で培養することによって行った。  2．ELISA法：培養上清中のTNF－αタンパク量の測定は，酵素結合免疫吸着法によって行った。  3．TNF－αmRNAの定jt：5pgの全RNAを用いてオリゴdTプライマーによる逆転写反応を行い，  （－）鎖cDNAを合成した後，定量性PCR法にてmRNA量を定量し，内部対照として用いたβ－aCtin   のmRNA量に対する相対値として表した。  4．THP－1細胞からの核内タンパクの抽出：プロテアーゼ阻害剤を添加した細胞溶解液を用いて細   胞質内タンパク，核内タンパクのそれぞれを抽出した。  5．SDS－PAGE：2511gの核内タンパクを含む各サンプルを，ポリアクリルアミドを12％に含むゲ   ル内で泳動し，タンパクを展開した。  6．ウェスタンプロット法：分画したタンパクをPVDF膜へウェットで転写した。5％スキムミルク   を含むトリス緩衝食塩水でブロッキング操作を行い，各DNA結合性タンパクの抗体と，HRP   酵素標識二次抗体とを反応させた。ペルオキシダーゼの化学発光基質により抗原抗体複合物の   検出を行った。   7．ゲルシフトアツセイ‥DNAプローブの標識とゲルシフト反応は，DIG GelSh拍Kit，2nd   Generation（Roche）を用いて行った。3，末端をDIGで標識したDNAプローブと核内タンパ   クとの反応物を，4％非変性ポリアクリルアミドゲルに泳動して分画し，エレクトロブロツテ   ィングによりポジティブチャージのナイロンメンプレンへ転写した。アルカリフォスファ   ターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を反応させ，化学発光基質を作用させることで検出した。  8．酵母one－hybrjdスクリーニング：上記のTNF－αプロモーター配列を同方向に3つ繋ぎ，栄養   マーカーHIS3をコードするレポータープラスミドpHIS2に挿入することでレポーターベク   ターを作製した。GAL4活性化ドメインとの融合タンパクとしてcDNAを発現させるベクター   pGADT7－Rec2と，上述のレポーターベクターおよびcDNAライブラリーとで酵母株を同時形   質転換した。ヒスチジン欠失SD培地で陽性となるone－hybrid反応をスクリーニングし，陽性   クローンのインサートの塩基配列のGenBankデータベースに基づくホモロジー解析を行っ   た。  9．免疫染色法：細胞を4％パラホルムアルデヒド中にて固定し，内因性ペルオキシダーゼ活性阻   害を目的として3％過酸化水素含有メタノールに浸漬した。ブロッキング後，一次抗体として   抗TARDNAbindingprotein（TARDBP）抗体を，二次抗体としてビオチン標識抗体を反応さ   せた。続いてペルオキシダーゼ標識ストレプトアピジンを反応させることによって抗体一酵   素複合体を形成させ，ジアミノベンディン基質を用いて発色させた。  【結果】  1．cDNAライブラリーを作製した時の細胞の性状  TNF－αタンパク産生量は，2～4時間のLPS刺激により最も顕著に増加した。TNF－αmRNA   発現量は，2時間のLPS刺激により最も顕著に増加し，それ以降は徐々に減少した。核内タン   パクの動向としては，NF－KB p65量は，LPS刺激後90分後まで増加し，その後は徐々に減少   した。LITAf量の変動は，NF－KBp65量の変動ほどは顕著ではないが，刺激によって増加傾向   にあった。核内タンパクのゲルシフトアッセイでは，質量の異なる3つのDNA一夕ンパク複合   体を検出し，競合アッセイにて，それらの複合体が標的DNAに特異的な結合反応によるもの   であることを確認した。  2．標的TN曹」αプロモーター領域に結合するタンパクの同定  酵母one－hybridスクリーニングの結果，104の陽性クローンのうち100クローンのインサー   ト塩基配列がヒト遺伝子に高い相同性を示した。そのうち，コード領域を含むものは41クロー   ンであり，標的DNAに結合するタンパクとして，最終的に14種類の候補が単離された。さ   らに，その中の3種類は，以下に示すTARDBPを含む，DNA結合性タンパクであった。  3．DNA結合性タンパクTARDBPのTHP－1細胞における発現動態と細胞内局在  ウェスタンプロットによって，TARDBPはLPS刺激下のTHP－1細胞において核内に産生される   ことが明らかになった。免疫染色では，rrARDBPはLPS刺激の有無にかかわらずPMAで分化さ   せたTHP－1細胞の核内に検出されたが，90分間のLPS刺激により強い染色を示す傾向があった。  【考察】  今回単離された14種類の転写制御因子候補のうち，DNA結合性の機能を有することが分かっ   ている3種類のタンパクと，－550～－487のmトαプロモーター領域との直接的な関与について   の既報はない。しかしながら，CDNAライブラリー作製時の細胞の性状や，TAR□BPの発現動態   から，それらがLPS誘導性に遺伝子発現し，核内に産生される因子である可能性が支持される。   TんRDBPは本来，核内に局在する性質をもつため，LPS刺激によりこの因子を産生する経路が促   進された可能性もあるが，本研究ではLPS刺激無しの状態との厳密な比較を行っていないことか   らも，経時的な発現動態をより詳しく観察する必要がある。  【結論】   酵母one－hybrid法を用いて，LPS刺激により単球で発現する遺伝子群から，TNF－αのプロモー   ター配列に結合する転写制御因子の候補を複数単離した。   論文審査結果の要 旨   腫瘍壊死因子－α（TNトα）は，免疫系の活性化や炎症反応に必要不可欠な炎症性メ  ディェ一夕ーであるが，過剰に産生されると自己免疫疾患や炎症性疾患の原因にもな  る。したがって，その産生メカニズムを解明することは，歯周炎を含む炎症性疾患の  治療を考える上で非常に重要な課題である。末梢組織でのmトαの主な産生細胞であ  る単球において，この遺伝子のプロモーター領域（－550～－487）には未知の転写制御  因子が複数結合する可能性が既報により示唆されている。   本研究では，その因子群の同定を目的とし，マクロファージ様に分化させ  1ipopolysaccharide（LPS）で刺激したヒト単球系細胞株であるTHP－1細胞に発現した  mRNAからcDNAライブラリーを作製し，酵母内でその発現タンパクと標的DNAと  を結合させる酵母one－hybrid法によって，上述のプロモーター領域に結合するタンパ  クを検索した。その結果単離されたDNA結合性タンパクについて文献考察を行い，  LPS刺激後のTHP－1細胞の核内でのタンパク量の変化を観察している。   申請論文は以下の内容を示すものであった。  1．マクロファージ様に分化させLPSで刺激したTHP－1細胞の核内において，既知  のmF－α転写因子が増加するという既報を確認し，また，mF－αプロモーター領  域（－550～－487）に結合するタンパクが複数存在することを示した。   2．酵母one－hybrid法によるスクリーニングの結果，標的のTNF－αプロモーター領域  に結合するタンパクの候補として，3種類のDNA結合性タンパクを含む14種類  のタンパクを同定した。   3．上記のDNA結合性タンパクの一つであるTARDNAbindingprotein（TARDBP）  は，分化したTHP－1細胞の核内に恒常的に存在し，LPS刺激を加えるとやや増加  する傾向を示した。   以上から，本研究は，複雑なmF－α転写制御機構の解明の一端を担うものであり，  mF－α産生機構の解明に貢献するものと認める。従って，本申請論文は博士（歯学）  の学位授与に値するものと判断した。   

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