Miyaji, Mary

Sano, Kuniaki

Tsutsui, Ken

Tsutsui, M. Kimiko

Okayama Igakkai Zasshi (Journal of Okayama Medical Association)

Okayama University Scientific Achievement Repository

143は じ め に　DNAトポイソメラーゼⅡ（トポⅡ）は二本鎖 DNA を切断・再結合することで，DNAの捻れや絡まりを解消する酵素である．この反応の前後で DNA の化学構造は変化しないが，DNAの高次構造（位相幾何学的構造）が変換される．また，トポⅡは細菌から高等脊椎動物まで普遍的に存在しており，哺乳動物ではαとβの２種類のアイソザイムが存在する．トポⅡαは細菌や酵母などのトポⅡと同様に分裂期の染色体分離に必須な酵素であり，抗腫瘍剤開発の対象として発見当初から多くの研究が行われてきた．一方，トポⅡβは，HeLa 細胞のような株化細胞では細胞周期によらず構成的に発現していることから，DNA修復などの過程に関与しているのではないかと推測されていたが，長い間明確な機能は不明であった．我々の研究グループは，トポⅡβの発見以前から成熟過程にある脳の神経細胞に強いトポⅡの活性が存在することを見いだしており，長年，中枢神経系におけるトポⅡβの機能の解析を行ってきた．　本稿では，我々がこれまでに行ってきた研究成果を中心に他のグループの知見なども含めて，中枢神経系の形成過程におけるトポⅡβによる遺伝子発現制御について述べる．DNAトポイソメラーゼⅡの反応機構　真核生物のトポⅡは，分子量160～180kDa であり，二量体を形成し機能する．図１にトポⅡの酵素反応サイクルを示す1,2)．まず，開いているＮ末端側のゲートから DNA 鎖（Ｇセグメント）を取り込み結合する．次に別の DNA 鎖（Ｔセグメント）を取り込んでＮ末端ゲートを閉じる．ゲートの閉鎖と連動してＧセグメントの切断が起こる．切断されたＧセグメントの５’端はトポⅡの活性中心にあるチロシン残基とホスホジエステル結合し，クリーバブル複合体と呼ばれる反応中DNAトポイソメラーゼⅡβによる神経関連遺伝子の 活性化機構佐 野 訓 明a＊，宮 地 ま りa，筒 井 公 子a，筒 井 　 研b岡山大学大学院医歯薬学総合研究科　a神経ゲノム学，b遺伝情報動態学キーワード：DNAトポイソメラーゼⅡβ（DNA topoisomeraseⅡbeta），神経細胞分化（neuronal differentiation）， 遺伝子発現（gene expression），神経関連遺伝子（neuronal gene），クロマチン（chromatin）DNA topoisomerase Ⅱβ activates a subset of neuronal genesKuniaki Sanoa＊, Mary Miyajia, Kimiko M. Tsutsuia, Ken TsutsuibDepartments of aNeurogenomics, bGenome Dynamics, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences岡山医学会雑誌　第121巻　December 2009, pp. 143ﾝ147　プロフィー ル佐野　訓明昭和44年９月14日生平成４年３月　岡山大学薬学部卒業平成９年３月　岡山大学大学院自然科学研究科博士課程　修了平成９年４月　岡山大学医学部　解剖学第三教室　助手平成15年４月　岡山大学大学院医歯学総合研究科　神経機能構造学分野　助手平成17年４月　岡山大学大学院医歯薬学総合研究科　神経機能構造学分野　助手平成19年４月　助手は助教となった平成20年４月　岡山大学大学院医歯薬学総合研究科　神経ゲノム学分野　助教　　　　　　　現在に至る　平成21年９月受理＊〒700ﾝ8558　岡山市北区鹿田町２ﾝ５ﾝ１ 電話：086ﾝ235ﾝ7097　FAX：086ﾝ235ﾝ7103 Eﾝmail：kuniaki@md.okayamaﾝu.ac.jp平成20年度岡山医学会賞（新見賞）受賞論文144間体を形成する．Ｔセグメントが，切断で生じたＧセグメントのギャップを通過すると，Ｇセグメントが再結合され，Ｃ末端側のゲートが開いてＴセグメントが放出される．Ｎ末端領域に結合した ATP が加水分解され，トポⅡのコンフォメーションが変化して，Ｇセグメントが解放されることで，一連のサイクルが終結する．抗腫瘍剤として用いられるエトポシドなどのトポ毒は，クリーバブル複合体を安定化することでトポⅡの活性を阻害する3)（図１）ために，増殖中の細胞で DNA の二本鎖切断を誘発し細胞死を引き起こす．一方，ICRF-193などのタイプの阻害剤は ATP の分解を阻害する結果，コンフォメーションの変化を抑制し，次の反応サイクルへの移行を阻止する4)．　トポⅡの機能の重要性がもっとも分かりやすいのは環状染色体が分離される場合である．環状 DNA の複製が終わったときには，生じた２つの娘 DNA 分子は連環を形成している．連環を解除するには，脱連環（デカテネーション，図２Ａ）活性が必要である．線状 DNA は位相幾何学的な連環は生じないが，大きな線状染色体の場合は核内構造により自由度が制約されているため，局所的に生じた絡まりは連環構造と等価である．その為に，真核生物の染色体分離においても脱連環活性は必須である．また，トポⅡは超らせん DNA を弛緩（リラクゼーション，図２Ｂ）させる活性も有している．この活性は分子内反応であり，転写や複製の進行によって生じる超らせん構造を解消して反応を継続させる働きをもっている．ただし，この弛緩反応はトポⅠなどの他のトポイソメラーゼでも代償可能である．トポⅡβはトポⅡαと同様に脱連環反応や弛緩反応を行うことができ，両者の酵素学的性質にはほとんど差異はない．DNAトポイソメラーゼⅡβの発見　先に述べたように，細菌や酵母などのトポⅡや脊椎動物のトポⅡαは染色体分離に必須な酵素であり，その量は細胞周期に同調して変化し，分裂期に最も多く，細胞分裂が完了すると速やかに分解される．したがって，分裂を停止した神経細胞などの最終分化細胞ではトポⅡαの発現量は少ない．その為に，トポⅡβが発見される以前は，トポⅡは分裂している細胞にのみ存在していると考えられていた5)．そのような状況下で，筒井らは増殖能を失った成熟した神経細胞の核に強いトポⅡ活性が存在することを初めて示した6)．そしてラット脳から cDNA をクローニングすることで，神経細胞で発現しているのは従来のトポⅡ（現在のトポⅡα）ではなく，1987年に発見された新規のアイフォーム7)，トポⅡβであることを報告した8)．トポⅡβは，トポⅡαとは別の遺伝子にコードされており9)，トポⅡαと異なり分裂増殖している株化細胞では細胞周期による量的変動は示さなかった10)．そのため，トポⅡβは DNA 修復など，より一般的なプロセスに関与しているのではないかと，当初は考えられていた．1234ADP＋PiATPICRF-193エトポシド図１　DNAトポイソメラーゼⅡの反応サイクル １. 結合，２. 切断，３. 再結合，４. 解離 また，エトポシドと ICRF-193の阻害部位を示すA B図２　DNAトポイソメラーゼⅡが触媒する反応 Ａ. 脱連環（デカテネーション）反応 Ｂ. 弛緩（リラクゼーション）反応145DNAトポイソメラーゼⅡβの生理機能　我々のグループは，当初からトポⅡβが成熟過程の脳で多く発現していることに注目しており，小脳の神経細胞分化におけるトポⅡβの機能を解析していた．発生過程の小脳での両アイソザイムの発現を調べたところ，分裂増殖している神経前駆細胞ではトポⅡαが強く発現しており，分裂を終えて神経細胞へと最終分化を開始するとその発現が止まり，代わりにトポⅡβが発現するようになる8,11)．神経細胞の分化時期に一致してトポⅡβの発現量は増加し，分化の終結とともに酵素活性は低下し，トポⅡβは核小体へ移行する12)．この小脳の発生過程では，様々な遺伝子の発現動態がダイナミックに変化することが知られており，我々はこれらの遺伝子の発現制御にトポⅡβが関与している可能性を検討した．そして，小脳顆粒細胞の初代培養系とトポⅡの特異的阻害剤を用いた解析から，終末分化過程にある神経細胞で発現が誘導される遺伝子の一部の転写を活性化するのにトポⅡβが必要であることが明らかになった13)．他のグループが作製したトポⅡβ欠損マウスの解析でも，新生児の神経筋接合部での末梢神経機能不全14)や胎生期の大脳皮質での層形成不全15)などが認められ，それらの現象を直接引き起こす責任遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった．これらの結果から，トポⅡβの生体内での主な生理機能が分化過程にある神経細胞における遺伝子の発現制御であることが示唆された．DNAトポイソメラーゼⅡβに制御される遺伝子群の同定　トポⅡβにより制御される遺伝子群の全体像をつかむ為に，我々は小脳顆粒細胞の分化過程における遺伝子発現をマイクロアレイで解析した16)．分化前のサンプルとして培養１日目（Ｄ１），分化後のサンプルとして培養５日目（Ｄ５），特異的阻害剤 ICRF-193で処理してトポⅡβの機能を阻害した培養５日目（Ｄ５＋）の細胞から RNA を調製し，発現解析を行った（図３）．培養経時的な発現誘導（Ｄ５/Ｄ１）を横軸に，トポⅡβの阻害による発現変化（Ｄ５＋/Ｄ５）を縦軸にした散布図を作製し，発現動態により９つの遺伝子群（Ａ１～Ｃ３）に分類した．この結果から，トポⅡβの阻害が転写自体や誘導される全ての遺伝子の発現に影響する訳でないことが明らかである．培養経時的に誘導され，かつ，トポⅡβの阻害でその誘導が抑制される一群の遺伝子（Ａ１遺伝子と呼ぶ）は，トポⅡβに依存して誘導を受ける遺伝子群であり，最も注目すべきものである．GO解析（※１）から，Ａ１遺伝子にはイオンチャンネル，輸送担体，神経伝達物質受容体などの神経機能に関連した膜に局在するタンパク質が有意に多く，機能的な偏りが有ることが分った．これに対して，トポⅡβ非依存的誘導を示すＡ２遺伝子ではこれらの機能の偏在は認められず，全く異なる機能の遺伝子群であった．　トポⅡβによる発現制御機構を解明するには，Ａ１遺伝子と他の遺伝子群の発現制御機構の違いを明らかに　 トポⅡｹによる神経関連遺伝子の発現制御：佐野訓明，他３名 　阻害無し阻害有り1 2 3 4 5培養日数mRNA コピー数培養経時的変化（Ｄ５/Ｄ１）阻害剤の影響（Ｄ５＋/Ｄ５）0.01 0.1 0.5 1 2 10 10010010210.50.10.01図３　DNAトポイソメラーゼⅡβで制御される遺伝子の同定146する必要がある．そこでまず，Ａ１遺伝子と他の遺伝子群とが位置するゲノム領域の比較を試みた．それぞれの遺伝子群をゲノムブラウザ（※２）で表示させると，Ａ１遺伝子は長く AT に富む遺伝子間領域に隣接し，遺伝子自体も長く AT に富むものが多いことに気づく．そこで，そのような遺伝子間領域を LAIR（Long and AT-rich Intergenic Region），遺伝子を LA 遺伝子として分類・定義した（分類の詳細に関しては文献16)を参照のこと）．Ａ１遺伝子の約２割は LA 遺伝子であり，他の遺伝子群に比べて有意に多かった（P＜10－15）．LA 遺伝子の多くが神経関連遺伝子であり，Ａ１遺伝子とも機能的に類似していることがGO解析で明らかになった．また，LA 遺伝子のうちどのくらいのものがトポⅡβで制御されているのかを検討する為に，発現動態が不明な LA遺伝子のうち小脳の発生過程で発現が誘導される遺伝子を選択し，逆転写定量 PCR で阻害剤感受性を調べた．その結果，候補遺伝子のうち８割（４/５）がＡ１遺伝子としての動態を示した．つまり，トポⅡβによって発現が活性化される遺伝子は，そのゲノム上の位置によって特徴づけられていることが明らかとなった．DNAトポイソメラーゼⅡβの作用部位の特徴　トポⅡβが制御しているＡ１遺伝子が同定され，それらの遺伝子が位置するゲノム上の特徴が分ってきた．そこで次に，Ａ１遺伝子が活性化される時にトポⅡβが作用しているゲノム領域（トポサイトと呼ぶ）を明らかにするため，トポⅡβが作用している DNA をＧセグメントとＴセグメントに区別する方法（eTIP 法：Etoposide-mediated Topoisomerase Immunoprecipita-tion 法）を開発した16)．培養後２日目の小脳顆粒細胞から eTIP 法で DNA 画分を回収し，少なくとも１個のＡ１遺伝子を含む７カ所，合計79メガベースのゲノム領域を網羅したオリゴ DNA タイリングアレイを作成して解析した．統計的に有意なシグナル強度と，プローブ近傍のGC含量を用いてクラスター解析を行うと，トポサイトは２種類のクラス（ｃ１とｃ２）に区別された．両者をゲノム上へマッピングしたところ，分布のパターンはトポサイトのGC含量と強い相関を示し，ｃ１サイトはGCに富む領域，ｃ２サイトは AT に富む領域に多く見いだされた．特に，ｃ２トポサイトは，LA 遺伝子上に有意に濃縮されており，LAIR に隣接したＡ１遺伝子ではその転写開始部位付近に集中していた．これは，トポⅡβが直接的にＡ１遺伝子の転写誘導に関わっていることを強く示唆している．お わ り に　長らく明確な機能が不明であったトポⅡβが，成熟過程にある神経細胞における遺伝子発現で重要な役割を果たすことが確実となり．トポⅡβによる新たな遺伝子発現制御の分子機構の一端が示された．特に，神経細胞の成熟や活動に不可欠な遺伝子が染色体上の一定の場所に集中して存在し（LA 遺伝子），それらの遺伝子の一部の活性化をトポⅡβが行っている可能性が示されたことは意義深い．統合失調症や自閉症などの精神疾患などと関連が強く示唆されている遺伝子では，LA 遺伝子の割合が40～50％と非常に高く，強い相関関係が認められている（未発表）．トポⅡβの機能の解明が，これらの疾患の研究・治療についても新たな展開をもたらすことが期待される．追 悼　本総説を作成中の2009年８月28日に神経ゲノム学分野の前身である第三解剖学教室の初代教授を務められました新見嘉兵衛博士が急逝されました．新見博士のご逝去に接し，ご生前のご功績を偲び，謹んで哀悼の意を表するとともに，心よりご冥福をお祈りいたします．用 語※１　GO（gene ontology，遺伝子オントロジー）解析　マイクロアレイなどで抽出された遺伝子群と統計的に関連のある生物学的概念（生理作用，細胞構成要素，分子機能）を探索する解析法．全遺伝子中に占める GO 用語の遺伝子の割合と抽出した遺伝子リストに占めるGO用語の遺伝子の割合についての有意差を検定する．※２　ゲノムブラウザ（genome browser）　ヒトや他の生物のゲノム情報を基に作製した塩基配列地図に様々なアノテーション（遺伝子構造，予測遺伝子，反復配列など）を付加した統合データベース，または，それを閲覧・利用する為のウェブサイトのこと．以下に例を示す．Genome Browser (UCSC)　http://genome.ucsc.edu/Ensembl (EBI & Sanger Institute)　http://www.ensembl.org/Map Viewer (NCBI)　http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/文 献１) Berger JM, Gamblin SJ, Harrison SC, Wang JC：Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature 

DNA topoisomerase Ⅱβ activates a subset of neuronal genes

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