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ヒト歯肉線維芽細胞でのIL-6/sIL-6Rによるカベオリン-1-JNK-AP-1経路を介したリソソーム酵素カテプシンB, L産生の促進

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論 文 要 旨 等 報 告 書氏授 与 した 学 位専攻分野の名称学位授与の番号学位授与の日付学位授与の要件学 位 論 文 題 名????口 知 子甲 第???816号平 成 2 1 年 3 月 2 5 日医歯薬学総合研究科病態制御科学専攻(学位規則第4条第1項該当)IL-6/SIL-6RenhancescathepsinBandLproductionviacaveolin-1-mediatedJNKIAP-1pathwayin humangingiⅤal 丘broblasts(ヒト歯肉線維芽細胞でのIL-6/SIL-6Rによるカべオリン-1-JNK-AP-1経路を介したリソソー ム酵素カテプシンB,L産生の促進)論 文 審 査 委 員 教授 滝川 正春 教授 高柴 正悟 准教授 苔口 進学 位 論 文 内 容 の 要 旨【緒言】歯周病は口腔細菌の感染によらて発症する炎症性疾患である.きた,炎症性サイ トカインは複雑にネットワークを形成して,歯周組織破壊を起こすことが知られている｡これまでに,インターロイキン6(礼-6)は,可溶性m-6受容体 (sm-6R)と複合体を形成してヒト歯肉線維芽細胞 (HGF)に作用し,VEGFの産生を促進させることが報告されている (NaruishietaZ.,2003)oこのことから,IL16は歯周病の悪化をきたす炎症性サイ トカインであると考えられる｡リソソーム酵素であるカテプシン B,Lは結合組織を破壊することが知られており,炎症性サイ トカインIL-1βがHGFのカテプシン産生を誘導することが報告された (Coxetal.,2006)｡しかし,礼-6によるカテプシン産生誘導に関する報告はないOカベオリン-1は,上皮細胞や線維芽細胞などの細胞膜上のラフトと呼ばれる糖脂質とコレステロールに富んだ領域に存在する細胞膜蛋白である｡近年,カべオリン-1が様々な炎症性サイ トカインの影響下にある刺激伝達系を修飾して,炎症反応を制御することが明らかになってきた｡したがって,本研究では,歯周病悪化のメカニズムの一端を明らかにすることを目的に,HGFでのⅠし6によるカテプシンの産生性,およびその刺激伝達系におけるカべオリン-1の関与を調べた｡【方法】1.HGFおよびその培養:HGFは,臨床的に健康なヒトの歯肉から分離 ･培養した線維芽細胞様細胞を用いた｡培養は,ウシ胎児血清を10%の割合に含むダルべッコ変法イーグル培地を用い,37oC,5%CO2存在下,95%湿潤下で行った｡なお,5-10代継代培養したHGFを実験に供した｡2.カベオリン-1のsmalintederitLgRNA(sim A)を導入したHGFの樹立:HGF-のカベオリン-1siRNAの導入は,市販のカべオリン-1siRNA (0-200nM,SantaCruZ)および,その対照 siRNA (0･200nM,SantaCruZ)を用いて,添付の使用説明書の記載に従って行った｡なお,siRNAの導入効率は,カベオリン-1siRNAを導入した48時間後のHGFの全細胞蛋白を回収し,ウェスタンブロット法によってカべオリン-1の産生程度を調べて評価した｡3･刺激伝達系の解明:SIL-6R･(50喝/ml)存在下において m-6(50mg/ml)を用いてHGFを刺激し,刺激伝達分子であるmitogen-activatedproteinkinase(MAPK)系(p44/42MAPKおよびC-JunN-teminalkinase:JNR)のリン酸化の程度を,ウェスタンブロット法により解析した.転写因子である activatorprotein1(AP-1)の核内移行は,同様に刺激したHGFの核内蛋白を回収した後,ゲルシフトアシセイ法により解析した.4.カテプシンB,L産生の検出:産生されたカテプシンB,Lは,上記2の実験系をもとに,100nMのカベオリン lーsiRNAを導入したHGFをm-6/sm-6R (ともに50ng/ml)で24時間刺激した後に全細胞蛋白を回収し,ウェスタンブロット法によって検出した｡なお,p44/42MAPK阻害剤であるPD98059あるいはJNK阻害剤であるSP600125を添加した正常のHGFにおいてもカテプシンの産生を調べた｡5.カテプシン B,L活性の測定:カテプシン活性は,Baretらの記載 (Methoゐ En野mOl,1981)に従って,リソソーム画分内のカテプシンによる基質分解度として測定した｡HGFのリソソー ム画分は,上記3と同様の実験系を用いて48時間刺激した細胞を超音波破砕し,超遠心した後の上清画分として回収したOカテプシンB活性は,リソソーム画分 (1帽)を反応基質 Ben野loxycarbonyl-i-Argininyl-L-Arginine-4-methylcoumary1-7-amide(Z-Arg-Arg-MCA)に作用させ,基質から遊離する 7-amin0-4-methylcoumaryn(AMC)の蛍光強度を測定して調べた｡また,カテプシンL活性は,細胞回収時にカテプシンB阻害剤であるCA-074Meを添加した際の細胞のリソソーム画分を反応基質Benzyloxycarbonyl-LIPhenylalanyl-L-Arginine-4-methylcoumaryl-7-am ideI(Z-Phe-Arg-MCA)に作用させて,前述と同様にAMCの蛍光強度を測定し,カテプシンB活性の抑制時のカテプシン (B+L)活性をもって表現した.なお,上記4と同様に,PD98059あるいはSP600125を添加した正常のHGFにおいてもカテプシンの活性を調べた｡6.統計処理:測定値の群間の有意差は,Student'si-testおよびANOVAnisher'sPLSDを用いて検定した｡【結果】1.IL-6は,HGFのp44/42MAPKおよびJNkのリン酸化を促進し,その下流のAP-1を活性化した｡これらは,カベオリン lーsiRNAを導入したHGI=こおいて有意に抑制された(p<0.05)02.臥-6は,HGFのカテプシンB,L産生を促進した.また,その結果に相応してカテプシンB,L活性も克進した｡しかし,siRNAを導入してカベオリン-1の産生を抑制すると,カテプシンB,Lの産生と活性は有意に抑制された (p<0.05).なお,JNKを抑制した正常のHGFにおいて,LカテプシンB,Lの産生と活性は有意に低下した (p<O.ゝ05)0一九 p44/42MAPKを抑制した場合では抑制されなかった.【考察および結論】HGFに作用したm･6がカべオリン-1-JR -AP-1経路を介してリソソーム酵素カテプシンB,L産生を促進することが明らかになった｡このことは,カべオリン-1がm-6が関与する歯周病の病態形成に関与することを示し,カべオリン-1の産生を制御することで歯周病の病態を変化できる可能性を示唆する｡論 文 事 査 鯖 黒 の 要 旨歯周病は口腔細菌の感染によって発症する炎症性疾患である｡ また,炎症性サイ トカインは複雑にネットワークを形成して,歯周組織破壊を起こすことが知られている｡これまでに,インターロイキン6(Ⅰし6)は,可溶性IL-6受容体 (sIL6R)と複合体を形成してヒト歯肉線維芽細胞(HGFs)に作用し,Ⅴ旦SCularEndothelialGrowthFactor(VEGF)の産生を促進させることが報告されている (Naruishietal,Transplantation,2003)｡ このことから,IL-6は歯周病の悪化をきたす炎症性サイ トカインであると考えられる′｡リソソーム酵素であるカテプシンB,Lは結合組織を破壊することが知られており,炎症性サイ トカJI-ンIL-1βがHGFsのカテプシン産生を誘導することが報告された(Coxetal,OralPis,2006)｡.このことから,IL-6についてもカテプシン産生誘導の可能性が考えられる｡カべオリン-1は,上皮細胞や線維芽細胞などの細胞膜上のラフトと呼ばれる糖脂質とコレステロールに富んだ領域に存在する細胞膜蛋白である｡近年,カべオリン-1が様々な炎症性サイ トカインの影響下にある情報伝達系を修飾して,炎症反応を制御することが明らかになってきた｡したがって,本研究では,歯周病悪化のメカニズムの一端を明らかにすることを目的に,HGFsでのIL-6によるカテプシンの産生性,およびその情報伝達系におけるカべオリン-1の関与を調べた｡申請論文は以下の内容を示すものであった｡1)IL-6は,HGFsのp44/42MAPKおよびJNKのリン酸化を促進し,その下流のAP-1を活性化した｡これらは,カベオリン-1smalinterferingRNA(siRNA)を導入したHGFにおいて有意に抑制された (P〈O.05)02)IL-6は,HGFsのカテプシンB,L産生を促進した｡また,その結果に相応してカテプシンB,L活性も克進した｡しかし,siRNAを導入してカべオリン-1の産生を抑制すると,カテプシンB,Lの産生と活性は有意に抑制された (p<0.05)0なお,JNKを抑制した正常のHGFsにおいて,カテプシンB,Lの産生と活性は有意に低下した (p<0.05).一方,.p44/42MAPKを抑制した場合では,カテプシンB,Lは抑制されなかった｡以上のことから,HGFsに作用したIL-6がカべオリン-1-JNK-AP-1経路を介してリソソーム酵素カテプシンB,L産生を促進することが明らかとなった｡このことは,Ⅰし 6が歯周病の病態形成に関与することを示し,カべオリン-1の産生を制御することで歯周病の病態を変化できる可能性を示唆する｡以上により,本申請論文は博士 (歯学)の学位論文として価値があるものと認めた｡

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