Murakami, Kaoru

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培養ヒト歯根膜細胞における幹細胞特性の解析

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論文要 旨 等報告書  氏  村 上 薫  授与した学位 博  専攻分野の名称 歯  学位授与の番号 博  甲  士  第 3581 号  学位授与の日付 平成 2 0 年 3 月 2 5 日  学位授与の要件 医歯学総合研究科機能再生・再建科学専攻（学位規則第4条第1項該当）  学位論文題名 培養ヒト歯根膜細胞における幹細胞特性の解析  論文審査委員 教授吉山昌宏教授山城隆 教授窪木拓男  学位論文 内 容の 要 旨  【緒言】  近年，再生医療という新しい医療が注目されてきている。再生医療を実現するためには，適切な幹細   胞を用いてそれぞれの組織を再生させていく必要がある。幹細胞は，胚性幹細胞（Embryonic stem  Cells：ES細胞）と体性幹細胞（SomaticstemcellsまたはAdultstemce11s）に大別される。体性幹細胞は，   ES細胞と比較すると多分化能の面では劣ると考えられているが，自己由来の幹細胞を用いることができ   るため，ES細胞を用いる際に問題となる倫理的■宗教的問題，組織適合性や奇形腫形成などの問題を   克服できるという利点がある。歯科領域においては，体性幹細胞の一つとして歯根膜幹細胞の存在が知   られている。歯根膜は抜去された鮭全歯から非侵襲的に容易に採取・単離することが可能であるため，  そこに存在する歯根膜幹細胞は再生医療に用いる幹細胞の理想的な供給源の一つであると考えられ   る。しかし，その性質についてはまだ十分に解明されていない。そこで，本研究ではこの歯根膜幹細胞   の特性を解明するために，ヒト歯根膜細胞の持つ未分化な表現型について検討を行った。  【資料および方法】  本研究は岡山大学医歯薬学給合研究科倫理委員会の承認のもとに行われた。提供を受けた健全・  抜去歯から歯根膜を採取し，培養を行った細胞を実験に使用した。タンパク質の発現は，フロー  サイトメトリー，免疫細胞rヒ学を用いて検出した。脂肪細胞・骨芽細胞・神経細胞への分化は分  化誘導培地を用い培養し，光学鯨微鏡もしくは蛍光顕微鏡下にて観察を行った。1nRNAの発現は，  RT－PCRを用いて発現塾を半定量的に評晰した。   【結果】   1．培養ヒト歯根膜細胞は，丸い核と細胞突起および紡錘形の外形を癖徴とする線維芽細胞様の形態を  呈し，CD29，CD44，CD71，CD73，CD90，CDlO5，CD166等の間英系幹細胞マーカーの発現が認め  られた。また，脂肪細胞・骨芽細胞・神経細胞への分化が認められた。   2．培養ヒト歯根膜細胞では，全細胞集団に対して約3．9％のSP細胞分画が認められた。また，ABC   √‾ トランスポーター阻害剤であるverapamil，reSerpineの添加によりSP細胞分画は90％以上  減少した。さらに，ABCトランスポーターであるABCG2の陽性細胞が約0．25％認められた。  加えて，ABCG2 mRNAはNon－SP分画よりSP分画で高い発現が認められた。   3．培養ヒト歯根膜細胞には，ヒト胚性幹細胞に特異的な表面抗原であるSSEA－3，SSEA－4、TRA一卜60，  TRA－l－81陽性細胞がそれぞれ約3．26％，29．42％，0．42％，0．21％認められた。また，SSEA－1陽性細胞  も約1．13％検出された。ヒト胚性幹細胞関連転写因子であるOCT4（99．19％），NANOG（99．95％），  SOX2（99．91％），REXl（96．43％）の発現はほぼすべての歯根膜細胞において認められた。蛍光免疫  細胞化学でも同様にSSEA－1，SSEA－3，SSEA－4，TRA－Lr60，TRA一卜81，OCT4，NANOC，SOX2，  REXlの全ての抗原の発現が認められた。  【考察および結論】  培養ヒト歯根膜細胞は，骨髄閉業系幹細胞と同様の形態，および表面抗原遺伝子の発現パターンお   よび分化能を持っており，間柴系幹細胞表現型を有する細胞を含んでいた。また，多くの幹細胞に共通   して認められるSP表現型を有する細胞を含んでおり，それはABCG2に依存的であった。さらに，胚性幹   細胞に特徴的に認められる表面抗原分子，転写因子を発現しており，胚性幹細胞表現型を有する細胞   を含んでいた。以上より，培養ヒト歯根膜細胞は，間葉系幹細川包表現型・SP表現型・睦性幹細胞表現型   という表現型を有する細胞を含んでおり未分†とな性質を持つ細胞が存在することが示された。本研究で   は，陛全抜去歯より採取できる培養ヒト歯根膜細胞は，これまで考えられていた以上に多くの未分化な性＿   質を持つ細胞であることが示された。これにより，培養ヒト歯根膜剥胞は再生医療における今後の研究や   臨床応f【1において，大きな可能性を持つ細胞であるということが示唆された。   論文審査結果の要 旨   近年の研究により，ヒト歯根膜に未分化な幹細胞が存在することが明らかとなっ  てきた。歯根膜は抜去された健全歯から非侵襲的に容易に採取・単離することが可  能であるため，そこに存在する歯根膜幹細胞は再生医療に用いる幹細胞の理想的な  供給源の一つであると考えられる。しかし，その性質についてはまだ十分に解明さ  れていない。そこで，本研究ではこの歯根膜幹細胞の特性を解明するために，ヒト  歯根膜細胞の持つ未分化な表現型について検討を行った。提供を受けた健全抜去歯  から歯根膜を採取し，培養を行った細胞を実験に使用した。タンパク質の発現は，  フローサイトメトリーや免疫細胞化学的手法を用いて検出した。脂肪細胞・骨芽細  胞・神経細胞への分化は分化誘導培地を用い培養し，光学顕微鏡もしくは蛍光顕微  鏡下にて観察を行った。mRNAの発現は，RT－PCRを用いて発現量を半定量的に評価  した。   その結果，培養ヒト歯根膜細胞の一部は，骨髄間葉系幹細胞と同様の形態，表面  抗原遺伝子の発現パターンおよび分化能を持っており，問葉系幹細胞表現型を有し  ていること，また多くの幹細胞に共通して認められるSP細胞表現型を有しており，  それは代表的なABCトランスポーターであるABCG2に依存的であること，さらに月杢  性幹細胞に特徴的に認められる表面抗原分子・転写因子を発現しており，胚性幹細  胞表現型を有していることが示された。以上より，培養ヒト歯根膜細胞には，間葉  系幹細胞表現型やSP細胞表現型，胚性幹細胞表現型を示し未分化な性質を持つ細  胞が存在することが示された。本研究では，健全抜去歯より採取できる培養ヒト歯  根膜細胞は，これまで考えられていた以上に未分化な性質を持つ細胞を含んでいる  ことが示された。これにより，培養ヒト歯根膜細胞は再生医療における今後の研究  や臨床応用において，大きな可能性を持つ細胞であるということが示唆された。  本研究は培養ヒト歯根膜細胞の一郭が，問葉系幹細胞表現型やSP細胞表現型，胚  性幹細胞表現型という未分化な表現型を示すことを初めて明らかにしたという点  において多大な新規性がある。また本研究は，ヒト歯根膜幹細胞に対する未知の新  しい知見を確認したという点において新規性の高い基礎的研究であることが高  く評価され，本論文審査委員会は，全会一致で，本学位申請論文が博士（歯学）の  学位を授与されるに値する論文であると認めた。   

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