Mandai, Toshiko

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論 文 要 旨 等 報 告 書  氏  万 代 とし子  授与した学位 博  専攻分野の名称 歯  学位授与の番号 博  甲   第 3 5 7 2 号  学位授与の日付 平 成 2 0 年 3 月 2 5 日  学位授与の要件 医歯学総合研究科病態制御科学専攻（学位規則第4条第1項該当）  学位論文題名 口腔癌における血管新生蛋白angiogeninの発現とその機能に関する研究  論文審査委員 教授 永井教之教授佐々木 朗准教授久保田聡  学 位 論 文 内 容 の 要 旨   【緒 言】  1985年に大腸癌細胞株HT29より分離された分子量14kDaのリボヌクレアーゼ活性を持  つ血管新生蛋白angiogenin（以下Angと略す）は，大腸癌，乳癌，前立腺癌，頭頸部癌な  ど種々の癌組織でその発現が冗進しており，腫瘍血管新生に重要な役割を果たすと考え  られている。Angのレセプターは未だ同定されていないが，血gは血管内皮細胞にエンド  サイトーシスにより取り込まれ，核へ移行し核小体に集積する。そして，血gはリボソー  ムRNA（rRNA）遺伝子のプロモータ領域に結合することによりrRNAの転写を刺激し，リ  ボソームの産生，蛋白質への翻訳，細胞増殖を誘導する。このAngの核への移行は，正常  の線維芽細胞や上皮細胞には起こらないが，最近，血管内皮細胞のみならず癌細胞に対  しても特異的に起こることが明らかとなった。したがって，Angは腫瘍血管新生作用と同  時に癌細胞自身への直接的な増殖作用を示すと考えられ，有望な癌の分子標的に成り得  る可能性を持つ。   本研究では，口腔癌におけるAngの発現を血管新生因子として代表的なvascular  endothelialgrowthfactor（VEGF）ならびにbasicfibroblastgrowthfactor（bFGF）と比較検討し，  特に固形癌の微小環境として影響力の強い低酸素環境下での低酸素誘導性因子（hypoxia  inducible factor－1α；HIF－1α）とAngの発現に注目し検討を行った。また，RNA干渉（RNA  interference；RNAi）を用いて口腔癌細胞におけるAngの発現をノックダウンし，さらにAng  の核移行の阻害剤であるneomycinを用いて，Angが口腔癌治療の分子標的となる可能性を  追究し，口腔癌におけるAngの機能の解析を行った。   【材料および方法】  1）口腔扁平上皮癌症例におけるAng，VEGFおよびbFGFの蛋白発現と腫瘍血管密度（MVD）  ならびにHIF－1α蛋白発現との関連の検討   対象は当科で加療を受けた口腔扁平上皮癌患者からの生検材料または前治療を行ってい  ない切除標本50例である。これらの標本の各血管新生因子およびHIF・1αの蛋白発現を免  疫組織化学的に検討した。なお，腫瘍微小血管を同定するためには抗ヒトCD31抗体を用  いた。  2）各種口腔扁平上皮癌細胞株におけるAng・VEGFおよびbFGFの発現に及ぼす低酸素のr  影響の検討  1  11種類のヒトロ腔扁平上皮癌細胞株HSC－2，HSC－3，HSC－4，KB，SAS，SCCKN，T3M＿  l，Sa3，KOSC－3，UMl，UM2において，通常培養（20％0ユ）および低酸素培養（2％02）  を行い，各血管新生因子の細胞外への分泌量をELISAにて測定した。また，HSC－2細胞に  おける通常および低酸素培養下で，HIF－1αの蛋白発現をウエスタンプロット法にて，Ang  およびVEGFmRNAの発現をリアルタイムPCR法にて解析した。   3）Angの発現抑制がHSC－2細胞の増殖および腫瘍血管新生に及ぼす影響の検討   AngおよびVEGFの分泌量が高いHSC－2細胞に，Angに対するsmallinterfering RNA  （siRNA）発現プラスミドDNAを遺伝子導入し，Angの発現をノックダウンした。そして，  AngsiRNA導入細胞株の増殖能の変化をinvitroおよびinvivoで検討した。また、この  導入細胞をヌードマウスの背部皮下に植え付け，形成された腫瘍組織のAng，VEGF，PCNA  およびHIF－1αの発現の変化を免疫組織学的に検討L］＝。なお，MVDの検討のために，  マウス腫瘍血管を抗マウスCD34抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。  4）NeomycinがHSC－2細胞のinvivoでの増殖に及ぼす影響の検討   HSC－2細胞をヌードマウスの背部皮下に植え付け，前項目3）と同様の検討を行った。  ′  【結果および考察】  1）口腔扁平上皮癌症例50例におけるAng，VEGFおよびbFGFの陽性率は，それぞれ  64％（50例中32例），56％（50例中28例）および14％（50例中7例）であった。これ  らの血管新生因子とMVDの間には明らかな有意差は認められなかったが，Ang，VEGF  およびbFGFの陽性症例群では，それぞれの陰性症例群に比べMVDが増加し，中でも  VEGFで顕著であった。一方，HIF－1αの陽性率は，72％（50例中36例）であった。ま  た，HIト1αと各血管新生因子の発現の関連に明らかな有意差は認められなかったがHIF－  1αの陽性症例群で，AngおよびVEGFが強発現する傾向にあった。しかしHIF－1αとbFGF  の発現に関連は認められなかった。  2）通常培養下でのA喝の分泌量は細胞株によって大きな差が認められ，低酸素培養下  で著明に冗進した。一方，VEGFの分泌量も通常培養下で細胞株によって大きな差が認  められたが，低酸素培養下では明らかな冗進は認められなかった。このため，HSC－2細  胞を例にとり低酸素培養下でのVEGF mRNAの発現畳も調べたが克進は軽度であった。  また，bFGFの分泌量は低酸素培養下でHSC－2細胞でのみ克進が認められたが，Angと  VEGFの分泌量に比べると全細胞で1／10以下と非常に少ないものであった。そして，HSC－2  細胞におけるHIF－1α蛋白およびAng mRNAの発現は低酸素開始6時間後にそれぞれ有意  な克進が認められた。一方，VEGF mRNAの発現は低酸素開始12時間後に軽度の冗進が  認められた。   以上の臨床症例および培養細胞株の結果から，口腔癌においては，血管新生因子Ang，  VEGFおよびbFGFの中でAngが最も低酸素環境の影響を強く受け，主にHIF－1αを介し  て強発現していると考えられた。  3）AngsiRNA導入細胞株では，その増殖スピードは親株に比べinvitroの無血清培養下  では48時間で2割程度であるが減少し，さらに，ヌードマウスに植え付けると劇的な増  殖抑制が認められた。そして，Angの発現は低下し，逆にHIF－1αとVEGFの発現は総  じて冗進していた。一方，PCNA陽性率とMVDは低下していた。したがって，Angは口  腔癌細胞の増殖に直接的に関与するだけではなく，口腔癌の低酸素領域でVEGFに匹敵  して腫瘍血管新生に関与すると考えられた。  4）ヌードマウスに移植されたHSC－2細胞の腫瘍組織に対し，neOmyCinによる明らかな  腫瘍増殖抑制効果が認められた。しかしながら，neOmyCin投与群の腫瘍組織においては，  対照群と比較して核におけるAngの発現，PCNA陽性率およびMVDの有意な低下を認  めるには至らず，口腔癌におけるneomycinの抗腫瘍作用およびその機序を解明すること  はできなかった。Neomycinのneamine部分では毒性が低く，Angの核への移行を阻害す  ることが報告されているが，今後，腫瘍血管新生阻害剤としてneamineによる口腔癌の  治療効果に関してさらに研究が必要と思われた。   【結 論】   A喝は口腔癌の増殖，進展ならびに腫瘍血管新生に重要であり，口腔癌の治療標的分  子として有用であると考えられた。   論文審査結果 の要 旨   Angiogeninは大腸癌細胞株HT129より分離された分子量14kDaのリボヌクレアーゼ  活性を持つ血管新生蛋白である。Angiogeninは，大腸癌，前立腺癌，頭頸部癌など  種々の癌組織でその発現が克進しており，腫瘍血管新生に重要な役割を果たすと考  ′ えられている。Angiogeninは血管内皮細胞にエンドサイトーシスにより取り込ま  れ，核へ移行し，リボソームRNAの転写を刺激し，リボソームの産生，蛋白質への  翻訳，細胞増殖を誘導する。このangiogeninの核への移行は，最近，血管内皮細胞  のみならず癌細胞に対しても特異的に起こることが明らかとなった。したがって，  angiogeninは腫瘍血管新生作用と同時に癌細胞自身への直接的な増殖作用を示すと  考えられ，その制御は有望な癌の分子標的療法の1つと成り得る可能性を持ってい  る。   本研究では，口腔京平上皮癌におけるangiogeninの発現を血管新生因子のvascular  endothelialgrowthfactor（VEGF）ならびにbasicfibroblastgrowthfactor（bFGF）と比較検  討し，特に固形癌の微小環境として影響力の強い低酸素環境下での低酸素誘導性因  子（hypoxiainduciblefactor－1α；HIF－1α）とangiogeninの発現に注目し検討を行った。  また，RNA干渉（RNAinterftrence；RNAi）を用いて口腔扁平上皮癌細胞における  angiogeninの発現をノックダウンしてangiogeninの機能の解析を行い，以下の結論を  得た。   1）口腔扁平上皮癌においては，血管新生因子angiogenin，VEGFおよびbFGFの中   でangiogeninが最も低酸素環境の影響を強く受けて活性化しており，腫瘍増殖  に必要な血管新生に重要な役割を果たすと考えられた。  2）Angiogeninの発現抑制動物実験より，腫瘍増殖が著しく抑えられたことから，  口腔扁平上皮癌の増殖・進展に重要であることが示唆された。  これらの知見は口腔扁平上皮癌におけるangiogeninの発現とその機能を明らかに  し，angiogeninが口腔扁平上皮癌の分子標的療法の標的分子として有用であること  を示すものとして価値のある研究業績である。したがって，本申請論文は博士（歯  学）の学位授与に値するものと判断した。   

口腔癌における血管新生蛋白angiogeninの発現とその機能に関する研究

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