Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011As grandes alterações climáticas do Pleistocénico desempenharam um papel central na distribuição actual dos padrões biológicos de diversidade que encontramos hoje em dia. As glaciações provocaram grandes alterações na distribuição das espécies que teriam de encontrar condições climáticas adequadas para a sua sobrevivência. Para isso, muitas espécies deslocaram a sua área de distribuição para latitudes inferiores, onde encontrariam refúgios climáticos, já que estariam impossibilitadas de usar os habitats das regiões mais setentrionais. Particularmente a Europa estaria coberta por grandes calotes de gelo no norte presentes também nas zonas montanhosas, mas manteria habitats mais quentes no sul. A Península Ibérica foi, indiscutivelmente, um dos refúgios de maior importância devido à sua heterogeneidade geográfica e climática, que providenciaria habitats diversos desde florestas de coníferas até semi-desertos. Inúmeros estudos têm-se debruçado sobre esta importância e as evidências observadas para vários grupos animais, de répteis a mamíferos e invertebrados, têm demonstrado que esta península era não só um refúgio importante mas seria também de onde expandiriam as espécies que iriam colonizar o norte da Europa, durante os períodos interglaciais. Estes movimentos de contracção e expansão das espécies foram constantes e cíclicos e levaram ao aparecimento de várias zonas de contacto secundário. Estas zonas caracterizam-se pela sobreposição de taxons diferentes, sejam eles filogeneticamente próximos ou não. Nestas zonas de contacto secundário é possível estudar vários processos que têm intrigado os investigadores evolutivos: como se mantém a identidade da espécie face a contacto com outros taxa numa área de simpatria; que barreiras existem que possam evitar ou impedir totalmente o cruzamento com entidades distintas e que forças selectivas actuam sobre os genótipos e fenótipos híbridos que podem resultar nestas circunstâncias, entre outros. Algumas espécies são particularmente sensíveis a pequenos distúrbios nas condições do habitat e as borboletas são especialmente importantes em estudos deste género já que, na sua grande maioria, as espécies de Lepidoptera são especialistas ecológicos estrictos. Para além desta particularidade, as borboletas apresentam um conjunto de características que as tornam bons modelos de estudo dos padrões filogeográficos. Têm por um lado uma grande capacidade de dispersão a nível global, mantendo algum sedentarismo quando analisamos em termos individuais e por outro, excepto nalguns casos, mantêm populações grandes e constantes, que não confundirão sinais filogeográficos com sinais de estruturação demográfica. Neste trabalho foi escolhida a espécie Lycaena bleusei, uma borboleta endémica da Península Ibérica, com uma distribuição restricta às zonas montanhosas do Sistema Central Ibérico. Esta espécie foi considerada como uma subespécie da Acobreada escura, Lycaena tityrus, até muito recentemente, mas foi-lhe atribuído o nível de espécie devido não só à sua distribuição discrepante, mas também a diferenças morfológicas subtis. O facto de esta história evolutiva ser pouco conhecida e da dificuldade de perceber os limites entre as duas espécies terá mantido a lacuna de conhecimento ecológico, comportamental e genético que caracteriza esta espécie. Alguns autores têm, recentemente, sugerido que a falta de prospecção da área ocupada pela L. bleusei pode estar a camuflar uma hipotética zona de simpatria em Portugal, onde as duas putativas espécies-irmãs estarão em contacto. De facto, e apesar de já ser considerada como uma espécie independente, estudos genéticos que incluam esta espécie são ainda raros ou mesmo inexistentes. Assim, utilizando a Lycaena bleusei como modelo, esta tese de mestrado pretende centrar-se na resolução das relações filogenéticas da espécie, enquadrando-a no género Lycaena e também na clarificação da sua história evolutiva, tendo por base a comparação com a espécie largamente distribuída na Europa, L. tityrus. A possibilidade de existir uma banda geográfica de simpatria entre estes dois taxon foi também avaliada, visando a possibilidade de ocorrer hibridação e introgressão neste grupo. Para tal, foi feita amostragem na área de distribuição da Lycaena bleusei, que cobriu não só a área de distribuição alopátrica, mas também a área de suposta simpatria. Populações de Lycaena tityrus foram também amostradas nesta zona, para serem utilizadas como base de comparação em termos ecológicos e genéticos, assim como algumas populações gregas. A análise foi feita com recurso a dois marcadores moleculares, um mitocondrial e um nuclear, citocromo oxidase I (COI) e Elongation factor 1 alpha (EF-1α) respectivamente. Estes marcadores têm sido utilizados em diversos estudos filogenéticos e a sua capacidade de resolução das relações nos diferentes níveis de classificação (i.e. subespécie, espécie, género, etc.) está bem descrita na literatura actualmente. Os dois loci utilizados provaram ser suficientes para distinguir as duas espécies em estudo, sendo possível atribuir a cada uma delas uma linhagem genética individual, quer mitocondrial quer nuclear, de forma clara e indubitável. Desta forma, foi possível posicionar pela primeira vez a espécie L. bleusei dentro do seu género com base em análises genéticas, aparecendo como esperado num clade monofilético com a sua espécie-irmã, L. tityrus. De acordo com as ideias descritas por outros autores, as espécies deste género que se encontram distribuídas pela região palearctica formam também um clade monofilético e as espécies americanas estão também agrupadas desta forma, excepto L. helloides e L. cupreus que se incluem no clade anterior. A análise dos sinais filogeográficos, dada quer pelas árvores quer pelas redes haplotípicas, indica uma clara separação das duas espécies, permitindo assim afirmar que, de facto, como sugerido por outros autores estamos perante duas espécies distintas, com uma diferenciação bem marcada (distância genética de 3,3% com o COI e de 2,3% com o EF-1α). A divergência entre as duas espécies parece ter ocorrido há cerca de 1 milhão de anos, correspondendo a um período interglacial relativamente extenso, o Waaliano. A par destes resultados, vem também a evidência de que cada espécie apresenta uma história demográfica independente, sendo que a Lycaena bleusei parece apresentar um aumento de efectivo populacional, correspondente a uma expansão demográfica que se terá iniciado há cerca de 30 000 anos. A sua espécie-irmã, L. tityrus, apresenta por outro lado um efectivo populacional que se tem mantido constante desde a sua divergência. No decorrer deste trabalho foi possível analisar detectar uma zona de simpatria, que mostrou ser mais alargada do que inicialmente previsto. Foram encontradas populações mistas das duas espécies na encosta oeste da Serra da Estrela, numa banda geográfica que se estende até ao norte de Portugal, onde inicialmente só se conhecia a espécie L. tityrus. Assim, à luz das condições actuais e ao facto de termos obtido um sinal genético que indica expansão demográfica da espécie L. bleusei, sugere-se que esta espécie está em crescimento demográfico, ocupando nichos ecológicos que anteriormente poderiam conter apenas populações de L. tityrus. É comummente aceite que hibridação é um evento relativamente comum entre os Lepidópteros e muitos são os casos já descritos na bibliografia e assim, na presença de uma zona de simpatria, era esperada a ocorrência de eventos de hibridação e introgressão. De entre toda a amostragem, dois indivíduos amostrados a norte de Portugal mostraram incongruências entre as duas linhagens genéticas utilizadas, linhagem mitocondrial (e características morfológicas) da espécie L. tityrus mas linhagem nuclear de L. bleusei. Os resultados obtidos neste trabalho parecem indicar que se trata de um processo raro ou incomum, podendo estar associado a questões genéticas e/ou a características morfológicas, comportamentais e ecológicas.From an evolutionary point of view the study of genetic diversity and the way it is distributed in the geographic space has always been of interest. Phylogeography tries to understand how the present distribution patterns of species and genetic lineages were shaped. The major climatic changes from the Quaternary, characterized by glacial and interglacial periods, led to species movements towards the South to find suitable habitats and climatic conditions during the glacial periods. One of the most important refugium in Europe was the Iberian Peninsula, where species could find a great variety of habitats. Studying species that are found today within this peninsula provides insights on how these global-scale events affected the distribution of genetic variation. In this research thesis, two butterfly species were used, Lycaena tityrus and Lycaena bleusei, whose evolutionary history and taxonomic classification have always been problematic. The Iberian Sooty Copper, L. bleusei, was considered, until very recently, as a subspecies of the Sooty Copper, L. tityrus, but was brought to species level for its distinct distribution and morphologic characteristics. Two molecular markers were employed, one mitochondrial gene – Cytochrome oxidase subunit I and one nuclear gene – Elongation factor 1α to assess: 1) phylogenetic relationships between these species among the genus Lycaena, clarifying their taxonomic relationship and 2) phylogeography and genetic structure of both species. Demographic changes and divergence times were also calculated, taking into account the suggested times for the Pleistocene changes, in order to understand how these climatic events influenced current species distributions and genetic architecture. We also used the genetic histories provided by each loci to account for incongruence between the mitochondrial and nuclear lineages. A secondary contact zone is described in northern Portugal and mixed populations were found. From all the individuals, two proved to have incongruent molecular histories suggesting the presence of hybridization events between the two copper species
