Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011O cancro e, actualmente, a segunda causa de morte no mundo ocidental, sendo o cancro colorectal, a terceira forma de cancro mais commumente diagnosticada, tanto no homem, como na mulher. Mais ainda, o cancro colorectal e a terceiraprincipal causa de morte relacionada com o cancro.A transformacao do tecido colonico normal e o desenvolvimento do cancro colorectal e considerado um processo faseado, com acumulacao de diferentes alteracoes geneticas e epigeneticas, que levam a transformacao do epitelio normal em adenoma e, mais tarde, em carcinoma. Adenomas ou polipos sao neoplasmas que, embora apresentem vantagem proliferativa inerente e reducao de diferenciacao, progridem para formas malignas em apenas 10% dos casos. Um dos principais eventos moleculares que pode conduzir ao desenvolvimento e progressao do cancro e a perda de estabilidade genomica que, no caso do cancro colorectal, esta associada a instabilidade de microssatelites e a instabilidade cromossomica. A instabilidade de microssatelites e caracterizada pela presenca de mutações em genes do sistema de reparacao de mismatchesno DNA, as quais podem resultar na inserção ou deleccao de repeticoes em microssatelites. Os microssatelites, por sua vez, sao pequenas repeticoes de sequencias de nucleotidos, contendo cerca de uma duzia de repeticoes de 4 a 6 sequencias nucleotidicas. As mutacoes geradas em cancros com instabilidade de microssatelites sao, inicialmente, aleatorias, afectando qualquer repeticao de microssatelite. Alguns clones podem, no entanto, adquirir mutacoes em genes chave, conferindo a celulavantagem proliferativa. A instabilidade cromossomica e o tipo de instabilidade genómica mais comum, ocorrendo em cerca de 80 a 85% dos tumores colorectais esporadicos, que não apresentam deficiencias no sistema de reparacao de mismatches noDNA. Tumores com instabilidade cromossomica estao associados a uma elevada frequencia de aneuploidias e desequilibrios alelicos, apresentando em geral, um prognostico pior do que tumores com deficiencias no sistema de reparacao demismatchesnoDNA. Nos neoplasmas colorectais e, ainda, comum a instabilidade epigenetica, a qual resulta da metilacao aberrante de genes supressores de tumores. Dentro dos tumores esporaricos com instabilidade de microssatelites, a instabilidade epigenetica manifesta-se atraves da metilacao do promotor de genes envolvidos na reparacao do DNA, nomeadamente do gene MLH1. Varias vias de sinalizacao que regulam o ciclo celular e a apoptose encontram-se desreguladas na transformacao, desenvolvimento e progressao tumoral, levando a um aumento descontrolado da proliferacao celular e a quase completa insensibilidade a estímulos pro-apoptoticos. Destacam-se a sobreactivacao das vias de sinalizacao das MAPKs, do NF-B e do PI3/AKT, que promovem a proliferacao celular, bem como a mutacao do p53, que inibe a apoptose numa elevada percentagem de carcinomas. A desregulacao da expressao de microRNAs (miRNAs) tem sido associada ao desenvolvimento de varios tipos de cancro, incluindo o cancro colorectal, atraves da alteração dos niveis de producao dos varios mediadores envolvidos nestas vias de sinalizacao celular. Os miRNAs sao pequenas moleculas de RNA nao codificante que regulam negativamente a expressao genica, a nivel pos-transcricional, atraves da repressao da traducao do mRNA alvo, ou da clivagem e degradacao do mesmo, estando este processo dependente do grau de complementaridade entre o miRNA maduro e o mRNA alvo. A accao dos miRNAs esta envolvida na regulacao de inumeros processos biologicos, nomeadamente na proliferação celular e na apoptose. Curiosamente, observou-se que o miRNA-143 (miR-143) apresenta expressao reduzida no cancro colorectal, assim como em outros tipos de cancro, sendo que um dos seus principais alvos biologicos e a ERK5. A accao do miR-143 na inibicao do crescimento tumoral, com modulacao da expressao de ERK5, foi ja demonstrada pelo nosso grupo, tanto in vitro, como in vivo. Nao existe, actualmente, qualquer informacao disponivel na literatura relativa a producao da proteina ERK5, ou da sua proteina activadora directa, a MEK5, no cancro colorectal. No entanto, o aumentonos niveis destas duas cinases foi ja observado em outros tipos de cancro, estando associado ao aumento de proliferacao, progressao tumoral e resistencia a terapeutica,para alem de se correlacionar com um pior prognostico da doenca. Um dos objectivos do presente trabalho foi analisar a producaodas proteina ERK5 e MEK5 durante o desenvolvimento e progressao do cancro colorectal, por forma a determinar se esta via de sinalizacao pode constituir um novo alvo terapeutico no cancro colorectal. Foi estudado um conjunto bem definido de 197 amostras humanas, incluindo tecido normal, adenomas e carcinomas, com e sem instabilidade de microsatelites. Os resultados demonstram, inequivocamente, que as cinases ERK5 e MEK5 se encontram aumentadas no cancro colorectal e que, possivelmente, a sinalizacao via ERK5 e um evento importante na iniciacao da transformacao tumoral. De facto, verificou-se um aumento significativo de ERK5 e MEK5 em adenomas, bem como em carcinomas, de forma independente da integridade do sistema de reparacao de mismatchesno DNA, relativamente ao tecido colonico normal. Sugere-se, assim, que a ERK5 podera representar um alvo terapeutico novo e relevante no cancro colorectal, possivelmente atraves da reducao da sua producao induzida pelo miR-143. O estudo de mediadores de outras vias de sinalizacao, importantes no desenvolvimento tumoral, como o NF-B e o AKT, revelou que estao alteradosdurante o desenvolvimento do cancro colorectal, tanto nos polipos, como nos carcinomas com e sem instabilidade de microsatelites. Confirmou-se, ainda, que a perda de funcao da proteina p53 esta envolvida na transicao de adenoma para carcinoma e que a frequencia de ocorrencia de mutacoes no p53 esta relacionada com a funcionalidade do sistema de reparacao de mismatches no DNA. Tendo em conta o conhecimento actual do potencial anti-proliferativo, pro-apoptotico e quimiosensibilizador do miR-143, possivelmente atraves da repressao da via de sinalização da ERK5, outro objectivo do presente trabalho consistiu no desenvolvimento de uma estrategia eficiente de entrega do miR-143, tendo em vista o seu uso como ferramenta terapeutica no tratamento do cancro colorectal. O maior obstaculo na aplicacao terapêutica dos miRNAs esta relacionado com o seu direcionamento para as celulas alvoin vivo, bem como com a sua estabilidade, uma vez que os miRNAs, nao modificados e desprotegidos, são instaveis em circulacao. O sistema de entrega em desenvolvimento neste estudo baseia-se na conjugacao do miR-143 com o cetuximab, ja utilizado no cancro colorectal como terapia dirigida. O cetuximab e um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor EGFR, frequentemente aumentado no cancro colorectal, promovendo a sua internalizacao e degradacao. O tratamento com este anticorpo melhora significativamente a sobrevivencia dos doentes e a progressao livre de doenca, sendo, no entanto, a sua eficacia dependenteda ausencia de mutacoes no KRAS. Sabendo que o miR-143 apresenta efectores especificos a jusante na via do EGFR, KRAS e ERK5, como principais alvos, o potencial terapeutico do miR-143 e elevado e poderá aumentar a eficacia do cetuximab. O objectivo ultimo e tirar partido da especificidade do cetuximab para direccionar o miR-143 para as celulas com producao aumentada de EGFR. A estrategia de entrega desenvolvida baseou-se na conjugacao do cetuximab com fluoresceína 5(6)-isotiocianato (FITC). De seguida, o anticorpo conjugado foi complexado com um anticorpo anti-FITC, conjugado com protamina (anti-FITC-protamina), numa proporção superior ao numero de moleculas de FITC conjugadas com o cetuximab, para garantir que todos os residuos de FITC no cetuximab estejam ocupados e, desta forma, maximizar a carga de miRNA em cada molecula de cetuximab. Por fim, o miR-143 sera marcado com o fluoróforo Cy3 e carregado nas protaminas. A protamina e uma proteina carregada positivamente, com afinidade para acidos nucleicos, que apresenta um grande potencial para a entrega de pequenos RNAs em celulas de cancro, ja demonstrado in vitro e in vivo. O progresso conseguido no desenvolvimento desta ferramenta permitiu demonstrar que o cetuximab conjugado com FITC manteve a capacidade de ligacao ao EGFR, para alem de que o complexo terapeutico constituido por cetuximab-FITC e anti-FITC-protamina foi entregue em celulas de cancro colorectal com niveis elevados de EGFR. Uma vez que a eficiencia desta ferramenta depende, em grande medida, da ligacao e internalizacao do complexo nas celulas alvo, os resultados obtidos ate agora reforcam o potencial desta estrategia de entrega, para alem de estimularem estudos futuros com vista a sua utilizacao terapeutica.Colorectal cancer (CRC) is a major health problem worldwide, with high incidence, representing a major cause of cancer related deaths. The development of CRC is considered a stepwise process, with the accumulation of genetic and epigenetic alterations, which contribute to transformation of normal colonic epithelium into adenoma, and eventually to carcinoma. The overexpression of ERK5 and MEK5 have been reported in many types of human cancer and correlated with increased cell survival, proliferation, chemoresistance and poor disease prognosis. Curiously, no information is available on ERK5 or MEK5 expression profiles in CRC. However, ERK5 expression is directly regulated by microRNA-143 (miR-143), typically downregulated in CRC. The aim of the present work was to evaluate the expression levels of ERK5 and MEK5 in normal colon, colon adenomas, and colon carcinomas. In addition, we aimed to develop an efficient delivery strategy for future use of miR-143 in CRC therapy, using cetuximab as a delivery vehicle. Our results provide the first human data demonstrating the aberrant overexpression of ERK5 and MEK5 in adenomas and, to a lesser extent, carcinomas. This suggests ERK5 as a potential target for the development of novel cancer therapies. Further, we confirmed a significant deregulation of NF-B and AKT signaling pathways, thought to be involved in cancer development and progression. p53, a key player in adenoma-carcinoma transition was also deregulated. Finally, we built an effective delivery complex, delivered to target cells with high affinity, highlighting the potential of this strategy for cancer cell delivery of miRNA therapeutics
