Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Funcionais), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013Neutrophils are among the first leukocytes to migrate from the blood to sites of inflammation. Here, they are able to recognize and engulf inflammatory agents, such as infectious agents and activate various anti-microbial strategies to inactivate and destroy them. Importantly, an efficient neutrophil recruitment and function will be pivotal for the success of the inflammatory response in recovering the host’s health. In inflammatory conditions, neutrophil recruitment from the bloodstream through the vascular endothelium into interstitial tissues requires successive interactions of neutrophils with the endothelial cells throughout this multistep process. Among diverse cellular adhesion molecules involved is the β2-integrin Mac-1 (CD11b/CD18), that by binding the endothelial ICAM-1 is specifically required during firm adhesion and leukocyte crawling. Additionally, this integrin has been shown to bind fibrinogen with a strong affinity as well as to its clotting product fibrin, among other molecular targets. Fibrinogen is a soluble glycoprotein present in the plasma that is importantly required for coagulation and the major determinant of blood viscosity and flow. It has been also proposed as a relevant player in inflammation in view of its ability to modulate the neutrophil function by potentiating degranulation, phagocytosis and antibody-dependent cellular cytotoxicity and by providing survival cues that delay apoptosis of activated neutrophils. One possible explanation for these effects could be that by binding Mac-1 in a low-avidity state, fibrinogen could function as a primer for resting neutrophils and thus decrease the threshold for cell activation. Taken all this, our goal in the present work was to address whether circulating fibrinogen could also modulate neutrophil recruitment and thus understand its role in the mechanism of microvascular inflammatory response. In this respect, we hypothesized that upon binding Mac-1, plasma fibrinogen could potentiate neutrophil-endothelial cell interaction by priming the neutrophil to a more adhesive phenotype. To test this, we first investigated whether soluble fibrinogen could modulate neutrophil activation, more precisely concerning the production of oxygen free radicals (OFR). By combining flow cytometry with dihydrorhodamine 123, we showed that by itself, soluble fibrinogen could induce OFR production by neutrophils isolated from human peripheral blood, arguing it could modulate neutrophil activation. Furthermore, we demonstrated this effect not to be Mac-1 dependent as: (i) fibrinogen did not interfere with the neutrophil Mac-1 activation and (2) an anti-total Mac-1 antibody known to block this integrin function did not impair the induced OFR production. Finally, binding of fibrinogen to the neutrophil’s membrane was observed independently of its co-localization with Mac-1 staining, arguing for the fibrinogen interaction with another unidentified neutrophil membrane receptor. Next, we addressed in vitro whether fibrinogen could modulate the adhesive behaviour of circulating neutrophils. For such, we used flow chamber assays that allowed the visualization and study of cell adhesion processes under well-defined wall shear stress. Human neutrophils were flown over monolayers of HUVECs at a constant wall shear stress of 0,1 dynes/cm2 in the presence or absence of soluble fibrinogen. Neutrophil’s adhesive behaviour was evaluated by determining the numbers of rolling and adherent neutrophils and the velocity of rolling. Under a physiological concentration (300mg/dL) of fibrinogen, the number of rolling neutrophils was not significantly affected in comparison to that measured in its absence. Surprisingly, the rolling velocities measured for the first were significantly higher than those exhibited by the latter. Additionally, the number of adherent fibrinogen-treated neutrophils was smaller than that determined for non-treated ones. This showed that at physiological concentrations, soluble fibrinogen could modulate the adhesive behaviour of circulating neutrophils towards activated endothelium. This effect may be important in a non-inflammatory condition by preventing excessive adhesion of neutrophils to the vascular wall and enabling adherent cells to easily detach from it. It may constitute an important mechanism to prevent unwanted accumulation of neutrophils in the vasculature and to avoid thrombus formation and growth. These results led us to propose that fibrinogen could further influence leukocyte recruitment in vivo and particularly, impact on the normal progression of acute inflammation. To explore this, the effect of soluble fibrinogen on leukocyte recruitment in acute inflammation was next evaluated in vivo by intravital microscopy of post-capillary venules of mouse mesentery. This approach allowed us to address specifically its contribution for leukocyte rolling and adhesion by determining the number of rolling leukocytes, their rolling velocities and the number of adherent leukocytes. To enable the in vivo study of leukocyte recruitment in the absence of soluble fibrinogen in the bloodstream, we made use of a mouse model bearing a disrupted fibrinogen α chain gene for which, homozygous individuals had been shown not to express any experimentally detected plasmatic soluble fibrinogen. As control groups, wild-type and heterozygous mice, known to possess normal coagulation patterns, were used. Acute inflammation was mimicked by superfusing the mesentery with PAF, a well-known neutrophil activator. Under these conditions, a slightly reduced number of rolling leukocytes was observed in homozygous (α-/-) mice when compared to both control groups. Despite this, rolling leukocytes migrated with increased velocities in homozygous (α-/-) mice when compared to those from control animals. Consistently, homozygous mice further displayed a diminished number of adherent leukocytes than the other groups. Overall, these observations led us to conclude that leukocyte recruitment is compromised in the absence of soluble fibrinogen in the blood circulation. Altogether our studies led us to conclude that soluble fibrinogen can modulate neutrophil activation and importantly, that it should constitute an important factor for leukocyte recruitment in acute inflammation. As soluble fibrinogen is able to bind either to the neutrophil or to the endothelial cell, one could envisage that it could also be able to bridge these two cellular identities and possibly favour a more stable and effective leukocyte recruitment. These results have profound implications in inflammation. As central players in the process, leukocytes need rapidly to cross the vascular wall and reach the inflamed areas. If this is affected due to absent or reduced levels of plasmatic soluble fibrinogen, ineffective immune responses will be elicited to invading pathogens. This will compromise the organism’s health by enhancing the risk of sepsis development among other possible pathological consequences.Os neutrófilos estão entre os primeiros leucócitos a migrar da corrente sanguínea para o local da inflamação. Um vez no local, estes possuem a capacidade de reconhecer e englobar os agentes causadores de infecções desenvolvendo estratégias anti-microbianas de forma a conseguir desativar e destruir esses mesmos agentes. Assim sendo, é importante salientar que um recrutamento de neutrófilos funcional e eficiente é fundamental para o sucesso da resposta inflamatória e para recuperação da saúde do hospedeiro. Em situações inflamatórias, o recrutamento dos neutrófilos é feito a partir do sangue e através do endotélio vascular para os tecidos intersticiais, este recrutamento consiste num processo com várias etapas que requer interações sucessivas do neutrófilos com as células endoteliais. Entre as várias moléculas de adesão celular envolvidas neste processo, é a integrina-β2, Mac-1 (CD11b/CD18), que permite que neutrófilos se liguem á ICAM-1 endotelial, passo essencial para a adesão firme dos leucócitos e o seu consequente alongamento. Além disso, foi também demonstrado que o fibrinogénio, assim como a fibrina, são ligandos de alta afinidade para esta mesma integrina, para além de outros alvos moleculares. O fibrinogénio é uma glicoproteina solúvel que está presente no plasma, sendo um dos elementos determinantes para o fluxo e viscosidade sanguínea, desempenhando ainda uma função fundamental na coagulação. Para além desta funções sobejamente conhecidas foi proposto por vários autores que fibrinogénio tem também uma função relevante no processo inflamatório tendo em conta a sua capacidade em modular a função do neutrófilo potenciando a sua desgranulação, fagocitose e atrasando a apoptose dos neutrófilos ativados. Uma das possíveis explicações para estes efeitos está diretamente relacionada com a ligação do fibrinogénio á Mac-1 quando esta se encontra em baixa afinidade, o fibrinogénio pode não só pre-ativar os neutrófilos mas também facilitar a sua ativação. Tendo tudo isto em consideração, o objetivo deste trabalho consiste investigar se o fibrinogénio solúvel que se encontra em circulação pode ou não modular o recrutamento dos neutrófilos e desta forma modular a resposta inflamatória microvascular. Na primeira abordagem a esta pergunta começou-se por investigar se o fibrinogénio solúvel ao ligar-se á Mac-1, poderia facilitar a interação entre as células endoteliais e os neutrófilos facilitando a sua adesão. Começou-se por tentar perceber se o fibrinogénio solúvel pode modular a ativação dos neutrófilos, tendo como medida de ativação a produção de radicais livres de oxigénio (OFR). Recorrendo á citometria de fluxo e á incubação dos neutrófilos com diidrorodamina 123, conseguiu-se provar que o fibrinogénio só por si induz a produção de OFR pelos neutrófilos isolados a partir de sangue periférico humano, ativando-os. Para além disso, demonstrou-se ainda que este efeito não é dependente da ligação do fibrinogénio á Mac-1, uma vez que, mesmo quando foi utilizado um anticorpo bloqueador da Mac-1 a produção de OFR não foi afectada. Para além disso, foi também verificado por microscopia confocal que não existe uma colocalização entre a marcação por Mac-1 e pelo fibrinogénio, o que sugere um receptor ainda não identificado para o fibrinogénio, na membrana do neutrófilo. Seguidamente, utilizando uma abordagem in vitro, investigou-se se o fibrinogénio conseguia modular o efeito adesivo dos neutrófilos em circulação. Para tal recorreu-se ao uso de uma camara de fluxo laminar que permitiu a visualização do processo de adesão com “shear-stress constante. Os neutrófilos isolados a partir de sangue periférico humano foram colocados sobre uma monocamada de HUVECs com um fluxo constante de 0,1 dynes/cm2 na presença e na ausência de fibrinogénio solúvel. O comportamento adesivo dos neutrófilos foi avaliado contando o numero de neutrófilos em rolamento e aderidos e determinando a sua velocidade de rolamento. A uma concentração fisiológica (300mg/dL) de fibrinogénio, o numero de neutrófilos em rolamento não foi afectado significativamente quando comparado com o numero encontrado na ausência de fibrinogénio. Mas surpreendentemente as velocidades de rolamento foram significativamente superiores na presença do fibrinogénio. Determinou-se ainda que o numero de neutrófilos aderidos na presença de fibrinogénio foi mais pequeno do que na sua ausência. O que conduziu á conclusão que o solúvel fibrinogénio em concentrações fisiológicas podem influenciar a adesão dos neutrófilos circulantes à parede endotelial ativada. Este efeito assume especial importância em situações não-inflamatórias, prevenindo a adesão excessiva de neutrófilos á parede vascular e também facilitando que células aderentes facilmente se libertem. Pode assim constituir um mecanismo importante para prevenir a acumulação não desejada de neutrófilos na vasculatura e impedir a formação e crescimento de trombos vasculares. Estes resultados conduziram a que se propusesse que o fibrinogénio pode influenciar o recrutamento dos leucócitos in vivo, e particularmente, ter um importante impacto na normal progressão de uma inflamação aguda. De forma a explorar esta hipótese, o efeito do fibrinogénio solúvel no recrutamento dos leucócitos durante uma inflamação aguda, foi utilizada uma abordagem in vivo, recorrendo á microscopia intravital das vénulas pós-capilares do mesentério do murganho. Esta abordagem permitiu visualizar diretamente e contar o numero de leucócitos aderidos e em rolamento assim como determinar as sua velocidades de rolamento. O modelo animal utilizado nesta abordagem foi um murganho geneticamente alterado, sem a cadeia α do fibrinogénio o que faz com que os indivíduos homozigoticos não possuam fibrinogénio em circulação. Como grupo controlo foram utilizados murganhos “wild-type” e heterozigoticos que possuem um padrão de coagulação normal. De forma a recriar uma situação de inflamação aguda, perfundiu-se o mesentério com PAF, um ativador de neutrófilos bem descrito na literatura. Nesta condições, foi encontrado um numero ligeiramente reduzido de leucócitos em rolamento nos murganhos homozigoticos(α-/-) quando comparado com o numero encontrado tanto nos murganhos heterozigoticos como nos “wild-type”. No entanto, a velocidade de rolamento é superior nos murganhos homozigoticos(α-/-) quando comparada com os mesmos grupos controlo. Consistentemente com este resultado, também o numero de leucócitos aderentes foi inferior neste grupo quando comparado com o mesmo grupo controlo. Estes resultados permitiram concluir que o recrutamento leucocitário ficou comprometido na ausência do fibrinogénio solúvel em circulação. De uma forma global, este trabalho permitiu concluir que o fibrinogénio solúvel pode modular a ativação dos neutrófilos e ainda constituir um factor importante para o recrutamento leucocitário durante uma situação de inflamação aguda. O fibrinogénio solúvel tem a capacidade de se ligar não só ao neutrófilo mas também ás células endoteliais, podendo assim servir de ponte de ligação entre estas duas identidades celulares e desta forma favorecer um recrutamento leucocitário mais eficaz e mais estável. Estes resultados tem implicações importantes no processo inflamatório. Sendo os neutrófilos células determinantes neste processo, precisam de conseguir atravessar rapidamente a parede vascular e chegar ao local onde ocorre a inflamação. Se este processo se encontra comprometido devido a uma concentração reduzida ou mesmo á ausência de fibrinogénio solúvel em circulação, a resposta imunitária fica comprometida e suscetível á invasão por agentes patogénicos. O que compromete a saúde do organismo aumentando o risco de um possível choque séptico entre outras consequências patológicas
