Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012O timo é o órgão linfóide primário responsável pela diferenciação de progenitores hematopoiéticos linfóides (PHL) em linfócitos T maduros. Após o nascimento, os PHL entram no timo através dos vasos sanguíneos e iniciam a timopoiese, processo complexo de diferenciação em linfócitos T. Os PHL começam por especificar-se na linhagem T e depois iniciam o seu longo processo de diferenciação adquirindo coreceptores de membrana característicos das células T maduras, como os marcadores CD3, CD4 e CD8. A timopoiese é essencial para a constituição de um sistema imunitário saudável. De facto, os linfócitos T são o componente principal do sistema imunitário adaptativo, capazes de responder a agentes infecciosos, e aumentando a capacidade de defesa do organismo com cada exposição a antigénios específicos. O timo é um órgão constituído por células epiteliais tímicas (CET), células mesênquimais derivadas da crista neural (CN), células dos vasos sanguíneos e células hematopoiéticas. O seu desenvolvimento está intimamente ligado ao das glândulas paratiróides, uma vez que os seus epitélios partilham a mesma origem embrionária: a endoderme das terceira e quarta bolsas faríngicas (3/4 BF)1,2. A origem endodérmica das células epiteliais foi pela primeira vez demonstrada por Le Douarin e Jotereau utilizando o modelo de quimeras galinhacodorniz3. Neste trabalho também mostraram que distintos mesênquimas ectópicos, são capazes de suportar (mesênquima permissivo, da somatopleura) ou não (mesênquima não permissivo, do sómito ou do botão do membro) o desenvolvimento da endoderme na formação dum timo funcional, revelando a importância das interações celulares entre a endoderme e o mesênquima adjacente, nas fases iniciais do desenvolvimento tímico3 Durante esta primeira fase do desenvolvimento tímico, ocorre a especificação das CET2. Os territórios presuntivos do timo e das glândulas paratiróides são definidos pela expressão de factores de transcrição distintos nas bolsas faríngicas, o gene Foxn1 (forkhead box N1) e o gene Gcm2 (glial cells missing-2), respectivamente4. Assim, em galinha, o rudimento do timo foi identificado ao dia 4,5 de desenvolvimento embrionário (E4,5) (E4 em codorniz) na região dorsal das 3/4 BF enquanto que o domínio das paratiróides ocupa um território mais anterior e ventral das mesmas5. A segunda fase do desenvolvimento do timo depende da sua colonização por PHL e de interações entre estes e as células epiteliais tímicas. Estas interações são essenciais para a diferenciação das CET em duas linhagens celulares, cortical e medular, originando consequentemente a formação de dois compartimentos tímicos: o córtex e a medula6–9. Durante a embriogénese, Le Douarin descreveu três ondas de colonização do epitélio tímico (ET) por PHL, no modelo de galinha10. A primeira onda ocorre ao E6,5 (E6 em codorniz), antes da vascularização do rudimento tímico, entrando os progenitores hematopoiéticos no rudimento tímico através da sua migração pelo mesênquima adjacente3,11,12. As restantes ondas realizam-se através dos vasos sanguíneos, ao E12 e E1810. As interações entre os PHL e as TEC são mediadas por vários factores solúveis, como citocinas (estimulam a proliferação dos timócitos) e quimiocinas (importantes na migração dos PHL para o rudimento tímico), e por vias de sinalização como a sinalização Notch. A importância do microambiente Notch para a correcta especificação de progenitores hematopoiéticos nas diferentes linhagens linfóides foi demonstrada pela primeira vez em 2001 pelo grupo de L. Parreira13. Além disso, os genes envolvidos na sinalização Notch (receptores, ligandos e genes-alvo) são expressos de forma distinta nos diferentes territórios do timo adulto, reforçando a importância desta via de sinalização na função do mesmo14. Recentemente, o grupo de H. Neves observou em embriões de galinha que os genes envolvidos na sinalização Notch estão diferencialmente expressos na endoderme das bolsas faríngicas, em estádios prévios à formação do rudimento tímico. Em estudos recentes, este mesmo grupo, utilizando o modelo de quimeras galinha-codorniz, observou que células da endoderme das 3/4 BF de codorniz (dador; E3) quando enxertadas num ambiente permissivo (mesênquima da somatopleura) dum embrião de galinha (receptor; E2,5), especificam em ET (Foxn1+). Também constataram que, 5 dias após o enxerto, o epitélio tímico se encontra colonizado por PHL com origem no embrião receptor (galinha)5. Contudo, quando a endoderme é enxertada num ambiente não permissivo (mesênquima do botão embrionário do membro posterior), nas mesmas janelas temporais, esta expressa Foxn1 mas não é colonizada por células hematopoiéticas5. Estes resultados sugerem que, quando enxertada num ambiente não permissivo, a endoderme não possui e/ou não recebe os sinais do mesmo (mesênquima adjacente) necessários à sua colonização por PHL. De facto, em codorniz, a primeira vaga de colonização do rudimento tímico por PHL (E6) ocorre durante a janela temporal em análise. Assim, este sistema representa um novo modelo de estudo para identificar os factores envolvidos na migração dos PHL e na colonização do rudimento tímico pelos mesmos, etapas fundamentais ao desenvolvimento do timo. Este trabalho teve como primeiro objectivo identificar os sinais moleculares da via de sinalização Notch envolvidos na fase de colonização do rudimento tímico (CET) pelos PHL. Para este efeito utilizou-se o modelo de quimeras galinha-codorniz acima descrito. Embriões quiméricos, com 3 e 5 dias de desenvolvimento após o enxerto da endoderme, foram sacrificados e estudados por hibridação in situ com genes envolvidos na sinalização Notch, especificamente os ligandos-Notch, Delta1 e Delta4. Os resultados obtidos mostram que a endoderme, quando enxertada no ambiente permissivo, expressa ambos os ligandos, nos dias 3 e 5 após o enxerto. Em contraste, quando a endoderme é enxertada num ambiente não permissivo, embora expresse Delta4, apresenta uma expressão diminuída ou inexistente de Delta1 (3 e 5 dias após o enxerto). Assim, os resultados sugerem que Delta1 poderá ser o ligando Notch específico envolvido na mediação do sinal Notch na interação entre o epitélio (ligando Delta1) e os PHL (receptor Notch) nas fases iniciais de colonização do epitélio tímico. Em conformidade, no timo adulto de ratinho foi descrita a expressão de Delta1 na junção cortico-medular, local de entrada dos PHL após o nascimento14. Atualmente, decorrem estudos para aprofundar o papel deste ligando e caracterizar a sua sinalização durante o processo de colonização do epitélio tímico. De futuro, também serão estudadas outras moléculas possivelmente envolvidas neste processo, tais como quimiocinas, e componentes de outras vias de sinalização. Em paralelo, neste trabalho caracterizou-se o desenvolvimento do timo e das glândulas paratiróides em galinha (entre os dias 5 e 18 de desenvolvimento), ao nível histológico e ao nível da diferenciação celular dos linfócitos T no rudimento tímico (por análise de citometria de fluxo). A análise histológica foi realizada através da expressão in situ dos genes Foxn1 e Gcm2. Em cortes seriados de parafina, ao longo dos estádios estudados (E5 a E13), observou-se a expressão de Foxn1 e Gcm2 nos rudimentos do timo e das glândulas paratiróides, respectivamente. Concluiu-se que a expressão destes factores de transcrição é mantida até ao dia E13. Mostrou-se também que as glândulas paratiróides apresentam uma morfologia adulta a partir de E9, e que o timo ao dia 13 de desenvolvimento se encontra ao longo do pescoço e diferenciado em dois compartimentos (córtex e medula). Analisou-se a dinâmica de diferenciação das populações de timócitos presentes no rudimento tímico, entre E11 e E18, por citometria de fluxo, utilizando os marcadores de membrana CD3, CD4 e CD8. Os resultados desta análise mostram que até E13 existem duas populações imaturas de timócitos, CD8+CD4-CD3- e CD3+CD8-CD4-, pouco proliferativas, e derivadas da primeira onda de colonização, sugerindo que podem ter um papel na especificação do epitélio tímico. De facto, no momento da segunda onda de colonização (E12-13) a medula começa a ser definida, evidência morfológica do processo prévio de especificação das células epiteliais em linhagens cortical e medular. Paralelamente, após a segunda onda de colonização (>E15) observa-se uma forte expansão de células duplas positivas, CD4+CD8+, sugerindo que estes timócitos têm uma maior capacidade de se diferenciarem (e expandirem) e possivelmente de contribuir para a maturação dos dois compartimentos tímicos.The thymus is the primary lymphoid organ where maturation of lymphoid progenitors cells (LPCs) into T-cell occurs. This maturation depends on interactions between the LPCs and thymic epithelium (TE). TE derives from endoderm of the 3rd and 4th Pharyngeal Pouches (3/4 PPs) (in chicken) and depends on epithelial-mesenchymal interactions and on LPCs colonization to become functional. Using the quail-chick model, our group showed that distinct mesenchymal tissues are permissive (somatopleure) or non-permissive (limb bud) to 3/4 PPs endoderm specification and early development. In addition, only in the permissive environment the endoderm is colonized by LPCs. In this work, we aimed to identify the molecular cues, namely Notch signaling ligands, involved in TE colonization by LPCs. For that, we used the quail-chick chimeric model. Using immunohistochemistry combined with in situ hybridization techniques we showed that Delta1, as opposed to Delta4, is down-regulated in the endoderm developed in the non-permissive mesenchyme (with no LPCs colonization). Together, these results suggest that mesenchymal-epithelial interactions are important to establish a proper environment to thymus formation and that Delta1 is involved in TE colonization by LPCs. In parallel, we described thymus and parathyroid glands development through the in situ expression analysis of specific transcription factors for each organ (Foxn1 and Gcm2, respectively). We observed that the expression of both transcription factors is maintained from E5 to E13 in the respective developing organs. We then characterized thymocyte populations during thymic organogenesis by flow cytometry analysis. We identified two immature populations, single positive for CD3 or CD8, at early thymic development (<E13), suggesting that these thymocytes may be important in TECs specification into different lineages (cortical and medullary), and subsequent maturation of thymic compartments. With this work, we hope to clarify important events in thymus organogenesis: colonization by LPCs and TECs specification
