Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012O citocromo dodeca-hemico GSU1996, da bacteria Geobacter sulfurreducens, e uma
proteína de estrutura linear, constituída por quatro domínios (A a D) e que actua, putativamente, como “nanofio” molecular, transferindo eletrões entre proteínas periplasmáticas ou para proteínas da membrana externa.
Neste trabalho, testou-se a aplicação de uma estratégia modular ao estudo deste novo e complexo citocromo c. Foi realizada a expressão heteróloga em E. coli de cada domínio individual e do fragmento CD que constitui o GSU1996. Dado o baixo rendimento na expressão dos domínios A e B, testaram-se alguns factores com vista a optimizacao das suas condições de expressão. No caso do domínio A, o melhor resultado ocorreu em E. coli JCB7123 induzida com 50 μM de IPTG, obtendo-se um rendimento final de 0,15 mg de proteína por litro de cultura.
Efectuou-se a atribuição dos sinais aos substituintes hemicos dos domínios A, C e D no
estado reduzido através de experiencias de Ressonância Magnética Nuclear. A abordagem modular foi validada na atribuição de sinais ao fragmento CD, em que se utilizou como guia a atribuição realizada nos domínios individuais que o compõem.
Para determinação de parâmetros termodinâmicos, realizaram-se testes de reoxidação aos domínios A e D a pH 8,0 e 16°C, tendo sido possível identificar os perfis de oxidação dos diferentes grupos hemo apenas no primeiro caso. Contrariamente ao esperado para um grupo hemo com coordenação axial His-Met e analogamente ao observado no domínio C, o grupo hemo IV e o que sofre maior grau de oxidação no primeiro passo de oxidação-redução, seguindo-se o grupo hemo I e, finalmente, o grupo hemo III.
Titulações de oxidação-redução do domínio A seguidas por espectroscopia de UV-visível indicam que nas condições experimentais utilizadas existe reversibilidade entre os processos. O valor de Eapp e -130 mV, sendo muito semelhante ao do domínio D.The dodecahemic cytochrome GSU1996, from the bacterium Geobacter sulfurreducens, is a linear structure protein, composed of four domains (A to D) which acts, putatively, as a molecular “nanowire” and transfers electrons between periplasmic or to outer membrane proteins.
In the present work, the application of a modular strategy to the study of this new and
complex cytochrome c was tested. Heterologous expression of each individual domain and tandem CD that constitute GSU1996 was performed in E. coli. Optimization was made in order to overcome the low yield obtained with domains A and B. Regarding domain A, the best result was attained through expression in E. coli JCB7123 induced with 50 μM IPTG, and a final yield of 0,15 mg of protein per liter of culture was obtained.
The assignment of the signals from the heme substituents of domains A, C and D in the
reduced state was accomplished through the spectra acquired with Nuclear Magnetic Resonance experiments. The modular approach was validated with the assignment of the signals to the tandem CD, in which was used the assignment of the individual domains C and D as a guide to achieve the tandem’s assignment.
In order to determine thermodynamic parameters, re-oxidation assays were performed with domains A and D. It was possible to identify the redox patterns of the different hemes at pH 8,0 and 16°C only for domain A. Against expectations and analogously to domain C, heme IV, with axial coordination His-Met, was the most oxidized in the first oxidation step, followed by heme I and finally, heme III.
Redox titrations from domain A monitored by UV-visible spectroscopy show that in the
experimental conditions used there is reversibility between both processes. Eapp in these conditions is -130 mV and it is very similar to that of domain D
