Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011The industry of cork stoppers is extremely important for Portuguese economy so there has been always a huge investment in this market row. The manufacture process of cork stoppers includes a series of stages that can favor molds development on cork planks. As a result, some compounds can be produced being a source of unpleasant flavors (such as cork taint of wine). At IBET exists a collection of fungi isolated along the years from different stages of cork stoppers manufacture process. A sample composed by 198 fungi was randomly chosen from that culture collection and was analyzed phenotypic and molecularly. Macroscopically, features like diameter, texture and color have been observed. For color coding an optimization was made in order to minimize the subjectivity associated to this parameter. Microscopic slides were prepared trying to describe the different reproductive structures of each isolate. For molecular techniques, the core sequence of phage M13 and [HVH(GACA)4] were used as primers for fungal DNA fingerprinting. 157 isolates from the genus Penicillium were identified and 26 fungi from the genus Aspergillus. Moreover, in a fewer proportion, it were also identified 2 fungi from the genus Chrysonilia, 3 fungi from Cladosporium genus, 5 from genus Mucor and 4 from genus Trichoderma. Although DNA fingerprinting did not reveal full diagnostic power to separate the isolates at species level, the utilization of other primers in association with M13 and [HVH(GACA)4] may improve this analysis. Moreover, it was observed that phenotypic characterization allowed the identification of fungi up to genus level. This characterization of the studied fungi complemented the information of each isolate of the culture collection. So, now the culture collection has more useful information and its access is facilitated.A cortiça é um produto natural proveniente da casca do sobreiro que tem inúmeras aplicações e pode ser reciclável. Por estes motivos, a cortiça é um produto muito rentável e para Portugal, sendo um dos maiores produtores de cortiça, tem sido muito importante para o desenvolvimento da economia. Em Portugal encontra-se cerca de 32% da distribuição mundial do sobreiro e em 2005 era o líder da exportação de cortiça num valor de 839 milhões de euros, dos quais 457 milhões devem-se à exportação de rolhas de cortiça. O sobreiro é uma árvore de folha persistente, de crescimento lento mas de elevada longevidade, podendo atingir 250 a 350 anos de vida. É apenas aos 43 anos da árvore que a recolha de cortiça é própria para a produção de rolhas pois é mais macia e regular. A cortiça é um tecido vegetal composto por células mortas, dispostas regularmente sem espaços intercelulares livres. É muito porosa devido à existência de canais lenticulares mas é impermeável aos líquidos. É constituída por soberina, linhina, polissacáridos como a celulose e a hemicelulose, taninos e ceras. As etapas de produção de rolhas de cortiça são numerosas. Inicia-se com o retirar das pranchas de cortiça da árvore e as que tiverem mancha amarela ou estiverem queimadas são postas de parte. Ocorre um período de maturação no exterior da fábrica, num piso inclinado para permitir a circulação de ar e drenagem das águas da chuva. Esta fase é importante para o aplanamento das pranchas e a eliminação de alguns compostos fenólicos, poeiras e insectos pela chuva. A próxima etapa é a cozedura das pranchas que leva ao aumento da humidade, da elasticidade e da espessura das mesmas, sendo assim mais fáceis de manusear. Segue-se um período de estabilização pós-cozedura de cerca de duas semanas para que a humidade não desça para níveis baixos. Ocorre num local bem ventilado e controlado para que não ocorra o crescimento descontrolado de microrganismos. Se este periodo de estabilização for muito longo, a humidade já baixou bastante então é necessário recorrer a uma segunda cozedura (menos demorada que a primeira) à qual se dá o nome de escalda. A etapa seguinte, rabaneação, consiste em cortar as pranchas em tiras e é seguida da brocagem que consiste em retirar porções redondas que vão constituir as rolhas. Por fim, ocorre uma separação das rolhas por classes (tamanho e aparência) e posterior lavagem e aclareamento das mesmas com água, peróxido de hidrogénio, ácido sulfâmico e metabissulfito de sódio. Em alguns casos, as rolhas podem ainda passar por um processo de colmatação para selar os poros da rolha. Antigamente sabia-se que as pranchas estavam prontas para serem trabalhadas quando estavam cobertas por um manto branco/rosado. Hoje em dia, através de estudos, sabe-se que esse manto corresponde ao micélio do fungo Chrysonilia. Sabe-se também que este fungo é o único visível enquanto a actividade de água se encontrar acima dos 0,9. No entanto, se o período de estabilização pós cozedura for longo, esta actividade de água diminui. Desta forma, outros fungos (por exemplo o género Penicillium), cujos esporos já existiam nas lenticelulas da cortiça, começam a germinar. Através de mais alguns estudos realizados sabe-se que Chrysonilia tem uma função importante na cortiça porque consegue degradar alguns compostos da parede celular da cortiça aumentando assim a maleabilidade desta e não produz 2,4,6-tricloroanisol (TCA) que é uma das principais causas do aparecimento do gosto a rolha nos vinhos. Por outro lado, os fungos que germinam depois de Chrysonilia desaparecer, têm a capacidade de produzir tricloroanisóis através da metilação de clorofenóis por isso, são considerados os principais responsáveis pelo gosto a rolha no vinho. Neste trabalho foi feita a análise de fungos isolados de diferentes etapas de produção de rolhas de cortiça. Esta análise foi primeiramente fenotípica através da observação das características macroscópicas e microscópicas dos fungos e posteriormente através da análise de perfis de „DNA fingerprinting‟ usando o „primer‟ M13 que corresponde à sequência core do fago M13 e o „primer‟ degenerado [HVH(GACA)4]. Também foi feita a preservação dos isolados em tubos com meio de cultura inclinado, em discos de micélio em água estéril e em suspensões de esporos. Toda esta informação obtida é importante para a constituição de uma colecção de culturas. Durante a caracterização macroscópica levantou-se o problema da subjectividade de alguns caracteres que iriam ser descritos de forma diferente de indivíduo para indivíduo. Numa tentativa de reduzir esta subjectividade, para a descrição da cor das colónias de fungos foi construída uma escala de cores às quais foram atribuídos códigos. Estes códigos correspondem às diferentes proporções de vermelho, verde e azul (RGB) da escala de cores que existe nos computadores formando assim uma enorme gama de cores. Através do programa NTSYS foi verificado que estes códigos poderiam ser utilizados para a descrição da cor uma vez que as diferentes cores ficaram separadas no dendrograma construído. Através da análise fenotípica foi possível identificar 6 géneros diferentes: Mucor, Aspergillus, Chrysonilia, Cladosporium, Penicillium e Trichoderma. Também foi possível formar grupos de espécies para os géneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que poucos isolados de Mucor (5), Chrysonilia (2), Cladosporium (3) e Trichoderma (4) foram encontrados na amostra em estudo (o estudo destes géneros foi abandonado nesta fase), apenas os géneros Aspergillus (26) e Penicillium (157) prosseguiram para a análise molecular. Para a análise dos dendrogramas obtidos associaram-se os dados moleculares com os dados fenotípicos, pois estes têm um elevado poder discriminante e como tal, é feita uma melhor separação dos isolados. Para o género Aspergillus a análise feita não foi suficiente para a separação dos isolados taxonomicamente. Para o género Penicillium os três clusters analisados tiveram resultados diferentes. No primeiro cluster, que era constituído por isolados de antes de cozedura, a raiz do dendrograma tinha um coeficiente de similaridade de 89,2% mostrando que estes são todos muito semelhantes. No segundo cluster com uma linha de corte a 75% houve formação de um cluster composto por 4 isolados da espécie Penicillium glabrum e todos eles isolados da fase de cozedura do processo de fabrico das rolhas de cortiça. Por fim, no terceiro cluster mais diversificado em termos de etapas e origem dos isolados, não foi possível a separação destes em grupos de espécies; no entanto, todos os isolados de discos de cortiça encontravam-se no mesmo cluster. Apesar de não terem sido identificados todos os isolados de fungos da cortiça, tentou-se fazer uma associação destes com as etapas de fabrico das rolhas a partir das quais foram isolados. Assim, verificou-se que o género Cladosporium aparece nas etapas antes de cozedura e escalda, o género Chrysonilia aparece nas etapas antes de cozedura e discos, Mucor aparece apenas na fase de estabilização pós cozedura e Trichoderma aparece antes de cozedura, cozedura e escalda. O género Penicillium foi encontrado em todas as etapas e o género Aspergillus foi encontrado apenas nas etapas antes de cozedura, cozedura e estabilização pós-cozedura. Com este trabalho concluiu-se que uma padronização deve ser feita para a descrição das características fenotípicas dos fungos. A escala de cores feita neste trabalho foi uma grande ajuda já que reduziu substancialmente a subjectividade de apreciação deste parâmetro. Apesar da análise molecular não ter sido discriminante taxonomicamente pode-se verificar que há alguma relação entre a existência de determinados géneros de fungos em etapas específicas do processo fabril. Por isso, em trabalhos futuros poderia-se completar este estudo e aprofundar o estudo da importância destes fungos para a manufactura de rolhas de cortiça
