Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012Adenosine is a neuromodulator with important actions in the nervous system. The activation of adenosine A2A receptors has been shown to modulate the action of other receptors. Considering that it was observed an interaction between adenosine A2A receptors and TrkB receptors in hippocampus, I hypothesized that the activation of A2A receptors could also facilitate BDNF actions on neuromuscular transmission. To answer that question I performed intracellular electrophysiological recordings in isolated preparations of the phrenic-nerve diaphragm from male infant rats. The data herein described clearly shows that there is a crosstalk between A2A receptors and TrkB receptors at the neuromuscular junction, where A2A receptors trigger the excitatory action of BDNF on neuromuscular transmission, through a mechanism that involves PLCy. When I was investigating the interaction between adenosine A2A receptors and TrkB receptors on neuromuscular transmission, I induced the increase of the endogenous adenosine level at the synaptic cleft, with an adenosine kinase inhibitor, 5`-iodotubericidin (ITU). It was observed that instead of inhibition, ITU greatly facilitated neuromuscular transmission. It was the first time that an excitatory effect induced by endogenous adenosine, at low frequency stimulation, was observed. Therefore I considered of interest to study the balance between adenosine A1 and A2A receptors at the neuromuscular junction upon ageing, since the activation of adenosine A2A receptors has been shown to influence the actions of adenosine A1 receptors and no one had looked at the excitatory actions of adenosine in aged rats at the neuromuscular junction. I performed intracellular electrophysiological experiments in isolated preparations of the phrenic-nerve diaphragm from four groups of male rats, with different ages: infant (3-4 weeks old), young adult (12-16 weeks old), older adult (36-40 weeks old) and aged (70-80 weeks old). The data herein reported clearly showed that there is a predominance of excitatory adenosine effects at the motor nerve endings of infant rats. Moreover, ageing influenced adenosine A1 and A2A receptors, at the motor nerve terminals, in a different manner. The actions of A2A receptors decreased with ageing, even disappearing in aged rats, whereas the actions of A1 receptors remained unchanged upon ageing. Furthermore, the actions of adenosine A2A receptors on neuromuscular transmission are dependent on adenosine A1 receptors activation, since the excitatory effect of A2A receptors was prevented by the adenosine A1 receptor antagonist. In conclusion, the data presented here demonstrate that adenosine A2A receptors play a crucial role at the neuromuscular junction, since their effects on neuromuscular transmission predominate over adenosine A1 receptors, in infant rats, and the excitatory effect of BDNF on neuromuscular transmission is dependent on their activation. The absence of adenosine A2A receptors effects in aged rats might be one of the causes of the neuromuscular transmission impairment. The results herein described are relevant for a better understanding on the role of adenosine at the neuromuscular junction upon ageing, opening novel scientific questions such as investigate the role of adenosine A2A receptors on neuromuscular transmission in the cenarios of neuromuscular disease as, for example, the amyotrophic lateral sclerosis disease.A adenosina é um importante neuromodulador do sistema nervoso. As suas acções estão dependentes da activação de receptores metabotrópicos associados às proteínas G. Os receptores A2A e os receptores A1 são considerados os receptores de alta afinidade para o ligando adenosina. A activação destes receptores desencadeia reacções intracelulares de natureza oposta. A activação dos receptores A2A da adenosina, por estarem associados a uma proteína G excitatória causa o aumento da concentração de uma molecula intracellular que desempenha a função de segundo mensageiro, o monofosfato de adenosina (AMP) cíclico. Pelo contrário, a activação dos receptores A1 da adenosina, que estão associados a uma proteína G inibitória, desencadeia a diminuição da referida molécula. Nos últimos anos tem sido demonstrado que os receptores A2A da adenosina, além de exercerem efeitos directos na libertação de diferentes neurotransmissores, também modulam as acções de outros receptores, como por exemplo os receptores inibitórios A1 da adenosina e os receptores do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor), os receptores TrkB. O objectivo do trabalho descrito nesta tese foi perceber o papel dos receptores A2A na modulação da transmissão sináptica na junção neuromuscular de diafragma de rato ao longo da idade (desde os juvenis até aos animais próximo do termo de vida), bem como investigar a interacção destes receptores com os receptores TrkB do BDNF e com os receptores A1 da adenosina. Utilizou-se uma abordagem funcional em que que se avaliou a transmissão neuromuscular evocada e espontanea, por métodos electrofisiológicos, em 4 grupos de animais com idades diferentes: juvenis (3- 4 semanas), jovens adultos (12-16 semanas), adultos de meia idade (36-40 semanas) e velhos (70-80 semanas). Tendo em conta que no hipocampo de rato as acções do BDNF são dependentes da activação dos receptores A2A da adenosina considerou-se importante avaliar se a interacção entre os receptores A2A e as acções do BDNF, observada no hipocampo de rato, se observa também ao nível da junção neuromuscular. Os resultados obtidos e descritos nesta dissertação mostram que o efeito excitatório do BDNF na junção neuromuscular depende da activação dos receptores A2A da adenosina. Mais, os resultados descritos nesta tese demonstram, pela primeira vez, que a interacção entre os receptores A2A e TrkB, na junção neuromuscular, se verifica através da activação da via de transdução da cinase de proteína do tipo A pelos receptores A2A, a qual permite a acção do BDNF, via receptores TrkB acoplados à lipase fosfatada do tipo C gamma, promovendo, desse modo, o aumento da transmissão neuromuscular. Quando estávamos a avaliar se a activação dos receptores A2A poderia facilitar o efeito do BDNF na transmissão neuromuscular, utilizámos uma ferramenta famacológica para promover o aumento dos níveis de adenosina endógena na fenda sináptica, isto é, adicionámos um inibidor da cinase de adenosina, iodotubericidina (ITU), ao banho de perfusão. A ITU impede a metabolização da adenosina intracelular em monofosfato de adenosina. O aumento da concentração de adenosina intracellular causa a sua libertação para a fenda sináptica através do transportador equilibrativo de nucleósidos. De modo inesperado a ITU, em vez de inibir, potenciou a transmissão neuromuscular de modo significativo. Este foi um resultado original, na medida em que nenhum autor, até agora, que seja do meu conhecimento, tinha descrito um efeito excitatório da adenosina endogena via receptores A2A, com um protocolo de estimulação de baixa frequência (0,5 Hz). Considerou-se, desse modo, importante investigar o equilibrio existente entre os receptores da adenosina A1 e A2A. Foi realizado um estudo farmacológico com o objectivo de investigar quais as condições que determinam a activação dos receptores A1 ou dos receptores A2A da adenosina. Os resultados que a seguir descrevemos documentam de modo claro que ambos os receptores de adenosina, A1 e A2A, presentes na junção neuromuscular de ratos jovens, podem ser activados por baixas concentrações de adenosina extracelular; no entanto a activação dos receptores A2A predomina. A maior parte das doenças neurodegenerativas tem incidência na velhice, no entanto existem poucos estudos em animais velhos ou muito velhos. Os receptores da adenosina têm assumido um papel cada vez mais relevante como alvo terapêutico para algumas doenças neurodegenerativas. Os poucos estudos que existem sobre o papel da adenosina na modulação da transmissão sináptica em animais envelhecidos foram realizados no sistema nervoso central. Por esse motivo considerámos importante investigar se o predomínio das acções excitatórias dos receptores A2A sobre os receptores A1, observado nos ratos juvenis, se mantem ao longo da idade. Este estudo permitiu obter um conjunto de dados que possibilitam caracterizar a fisiologia da transmissão neuromuscular ao longo da vida. Observámos que a transmissão sináptica, ao nível da junção neuromuscular de diafragma de rato, se mantém inalterada ao longo da vida, ficando comprometida apenas na velhice. Os animais muito velhos apresentam a amplitude e o conteúdo quântico dos potenciais evocados de placa motora, bem como a frequência dos potenciais miniatura de placa motora significativamente diminuídos. Em relação ao efeito da idade nos receptores de adenosina, os resultados apresentados demonstram que a idade influencia os receptores de adenosina A1 e A2A de modo diferente. A amplitude dos efeitos excitatórios causados pela adenosina libertada endogenamente ou por um agonista inespecífico A1/A2A tendem a diminuir ao longo da vida, desaparecendo nos animais muito velhos, altura em que apenas a inibição medidada pela activação dos receptores A1 é observada. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os receptores A2A de adenosina têm um papel crucial na manutenção da transmissão neuromuscular, uma vez que as suas acções predominam sobre as dos receptores A1 e as acções do BDNF dependem da sua activação. A ausência de efeitos excitatórios dos receptores A2A nos animais muito velhos pode constituir uma das causas para o comprometimento da transmissão neuromuscular observada nessa idade. Os resultados que se descrevem na presente dissertação são relevantes para uma melhor compreensão do papel da adenosina na junção neuromuscular ao longo do envelhecimento, abrindo novas questões científicas, tais como investigar o papel dos receptores A2A da adenosina na transmissão neuromuscular em situação de doença neuromuscular, por exemplo na esclerose lateral amiotrófica
