Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A poluição ambiental induzida por substâncias químicas é considerada um grave problema a nível mundial e o uso generalizado de pesticidas é, talvez, o tipo de poluição química mais preocupante da actualidade, afectando todo o planeta, incluindo a saúde humana. A agricultura é uma importante actividade na economia de muitos países, mas é, ao mesmo tempo, a grande responsável pelo aumento do consumo de pesticidas a que temos vindo a assistir, ao longo dos tempos. Em Portugal, de acordo com o Eurostat, aproximadamente 17000 toneladas de pesticidas foram vendidos em 2008, contrastando com menos de 13000 toneladas vendidas em 1997. Pode considerar-se que os pesticidas são uma ferramenta económica, eficiente e racional no controlo de pragas pois, teoricamente, são desenvolvidos através de processos de regulamentação muito rígidos para que funcionem com segurança e mínimo impacto na saúde humana e no ambiente. No entanto, a maioria das vezes, os estudos publicados não estão em concordância com este facto e surgem, cada vez mais, preocupações relativamente aos riscos para saúde, decorrentes não só da exposição ocupacional aos pesticidas, mas também da exposição a resíduos destes químicos, presentes nos alimentos, que vão atingir toda a população. Consequentemente, nos últimos anos, procuram-se alternativas viáveis ao uso de pesticidas e a agricultura biológica pode ser uma opção a considerar. De facto, este tipo de agricultura não usa qualquer tipo de produto químico, sendo baseada na utilização de inimigos naturais para o combate de pragas. Todavia, esta prática é muito controversa, pois parece não ter ainda o potencial para responder a uma produção em massa, necessária para alimentar toda a humanidade. Assim, é essencial que se faça mais investigação nesta área de forma a entender as verdadeiras potencialidades, constrangimentos e limitações desta prática, que pode ser a chave para a resolução do grande problema do uso de pesticidas. O Mancozeb é um dos fungicidas mais usados a nível mundial, principalmente devido à sua baixa toxicidade aguda para os mamíferos e escassa permanência no meio ambiente. Apesar disto, o Mancozeb, principalmente através de um dos seus produtos de degradação, a etilenotiureia (ETU), tem efeitos toxicológicos ao nível da tiróide, sistema imunitário, reprodutivo e nervoso. Para além disto, o Mancozeb parece ter actividade mutagénica, teratogénica e ainda carcinogénica, tendo-se verificado que induz uma variedade de tumores de diferentes origens em ratos, após uma exposição crónica. Há ainda a referir que o manganês (Mn), constituinte deste pesticida, também é um agente mutagénico comprovado, causando danos no material genético. Apesar de tudo isto, o Mancozeb está incluído na lista (Anexo I da directiva 91/414/EEC, 1991) de substâncias activas consideradas aceitáveis, tendo em conta o seu impacto no ambiente, saúde animal e humana, sendo o seu uso legalmente autorizado na formulação de pesticidas dentro da Comunidade Europeia. A avaliação ambiental da toxicidade dos pesticidas pode ser feita através da utilização de pequenos mamíferos roedores, que vivem nos campos, uma vez que estes são bons bioindicadores, acumulando um vasto espectro de poluentes presentes nos ecossistemas. Particularmente em relação aos pesticidas, existem já algumas correlações significativas entre exposição e a ocorrência de danos genéticos nestes animais. Por outro lado, estes animais têm a vantagem de ter grandes semelhanças genéticas e fisiológicas com os humanos, permitindo a extrapolação dos efeitos dos pesticidas. Assim, o principal objectivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade dos pesticidas, in situ, comparando o estado de saúde de duas espécies de roedores (Mus spretus e Apodemus sylvaticus), provenientes de uma zona de agricultura convencional em contraste com os de uma zona de agricultura biológica. Para isto, foi necessária a colaboração dos agricultores em causa, que se mostraram sempre disponíveis, e forneceram toda a informação necessária. Assim, o agricultor responsável pelo campo de agricultura biológica garantiu que não eram usados quaisquer tipos de substâncias químicas, tratando-se de uma zona que sofreu conversão há cerca de 5 anos. Da agricultura convencional foi fornecida uma lista de pesticidas usados, onde os insecticidas organofosforados, carbamatos, juntamente com alguns EDBCs eram os principais grupos químicos de pesticidas usados. Para além disto, o agricultor da zona convencional informou que mais de 50% das aplicações eram baseadas num fungicida EDBC, o Mancozeb, sendo então este o pesticida maioritariamente aplicado. Depois de capturados e sacrificados, os animais foram avaliados do ponto de vista morfofisiológico, através das medidas biométricas, peso relativo dos órgãos internos e parâmetros hematológicos. Foram ainda sujeitos a três testes de forma a avaliar os danos ao nível do material genético: ensaio do cometa nos linfócitos, teste dos micronúcleos na medula óssea e teste das anomalias nos espermatozóides. Para além disto, foi feita a determinação da actividade da acetilcolinesterase no cérebro, que é um biomarcador da exposição a insecticidas organofosforados e carbamatos, e a quantificação do manganês (Mn) no fígado, que pode servir para avaliar a exposição ao Mancozeb, uma vez que este metal entra na sua constituição. Foi, ainda, iniciada uma análise molecular no intuito de determinar polimorfismos do gene CYP1A1, que está envolvido no processo de desintoxicação de agentes xenobióticos, como os pesticidas. Como resultado, o presente estudo demonstrou claramente que a exposição a uma mistura de pesticidas, onde o Mancozeb representa mais de 50% dessa mistura, tem a capacidade de causar danos genéticos em pequenos mamíferos, avaliados pelos ensaios do cometa, micronúcleos e anomalias nos espermatozóides. Para além disto, de forma a provar que, de facto, o Mancozeb era o agente genotóxico em causa, foi feita a quantificação do manganês no fígado dos animais, através da técnica de Espectrofotometria de Absorção Atómica com Câmara de Grafite. Assim, concluiu-se que os animais de ambas as espécies da zona da agricultura convencional, expostos a pesticidas, com maiores níveis de danos genéticos, tinham também maiores níveis de Mn no fígado, comparativamente aos animais da zona de agricultura biológica. Ou seja, o Mancozeb, sendo a fonte destes níveis de Mn mais elevados, será o agente genotóxico em causa. Por outro lado, foi feita a avaliação da actividade do enzima acetilcolinesterase, no cérebro, para despistar possíveis efeitos de insecticidas organofosforados e carbamatos, que também podiam ser a causa das diferenças nos danos genéticos encontrados entre as duas zonas analisadas. No entanto, verificou-se que não havia diferenças significativas nos valores da actividade deste enzima, entre os animais das duas zonas, que pudessem justificar os valores superiores de danos genéticos encontrados na zona de agricultura convencional. Foi ainda feita uma análise morfofisiológica para verificar se os animais expostos aos pesticidas tinham esses parâmetros alterados, mas apenas os baços aumentados foram reveladores da infecção provocada pela exposição aos pesticidas. Por outro lado, foi feita uma análise genética preliminar, no intuito de encontrar polimorfismos no gene CYP1A1, mas não foi possível conclui-la e, futuramente, será necessário continuar esta abordagem molecular do estudo. Tendo em conta as diferentes sensibilidades das duas espécies bioindicadoras analisadas, este estudo mostra como é importante usar pelo menos duas espécies simpátricas para detectar a presença de agentes genotóxicos e utilizar vários testes de avaliação dos danos genéticos, porque a variabilidade em espécies selvagens é bastante mais elevada relativamente a animais de laboratório. Por outro lado, verificou-se que, de facto, a quantificação do Mn, tem potencial para ser um biomarcador da exposição e este tipo de pesticidas, que têm metais na sua constituição. Este estudo fornece ainda valores de referência para os biomarcadores utilizados em estudos futuros e demonstra como M. spretus e Apodemus sylvaticus são duas espécies indicadas para serem usadas como bioindicadores de poluição provocada pelos pesticidas. Concluindo, o presente estudo demonstra que a prática agrícola convencional representa um maior risco genotóxico comparativamente à agricultura biológica e contribuiu para alertar acerca dos efeitos prejudiciais que advêm da exposição aos pesticidas a longo prazo, particularmente, da exposição ao Mancozeb, que é um pesticida de uso legalmente autorizado na Comunidade Europeia. Apesar de vários estudos indicarem uma elevada toxicidade do Mancozeb, este continuará a ser um dos pesticidas mais usados no mundo, devido á sua eficácia, baixo custo e baixa persistência no ambiente relativamente a outros pesticidas. Assim, grande parte da população vai continuar a ser exposta e a problemática dos seus efeitos a longo prazo continuará a existir, enquanto não forem feitos investimentos na descoberta de alternativas ao uso de pesticidas.Pesticides are widely used for pest control in conventional agriculture, despite their negative impacts. Biological agriculture can represent a valuable option, avoiding the use of pesticides, but it does not appear to have the potential to respond to the mass production of food to feed humanity. Mancozeb is a widely used fungicide mainly because of its low acute toxicity in mammals and scarce persistence in the environment. However, it has been considered a multipotent carcinogen, mutagenic and possibly teratogenic in a longterm exposure context. Small mammals can be used as bioindicators of environmental toxicity of pesticides, accumulating a wide spectrum of pollutants, and significant correlations between pesticides and genetic damage in free-living rodents have already been detected. The main aim of this study was the in situ assessment of pesticide toxicity, using two small mammals’ species (Mus spretus and Apodemus sylvaticus) from a conventional agriculture (CA) versus a biological agriculture (BA) zone. It was found that exposure to a mixture of pesticide, where Mancozeb represents more than 50% of that mixture, has the ability to cause DNA damage in small mammals, assessed by comet, micronucleus and sperm abnormality assays. Moreover, both species from CA zone, exposed to pesticides, with greater genetic damage, have also greater levels of Manganese. Thus, considering that Mancozeb is the widely used pesticide in the CA zone, we can conclude that this pesticide will be the source of the highest levels of manganese found in small mammals and it is the genotoxic agent at issue. Moreover, acetylcholinesterase activity revealed that organophosphates and carbamates insecticides also applied are not involved in that genotoxic action. In conclusion, the present work contributes to alert about hazard effects resulting from pesticide exposure, particularly Mancozeb, a pesticide legally authorized for use in European community
