Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Mesenchymal stromal cells (MSC) from the umbilical cord (UC) are a promising tool for regenerative medicine due to their easy acquisition, high expansion potential and the ability to differentiate into multiple lineages. In particular, the capacity for osteogenic differentiation makes them of great interest for clinical application in bone repair. In this work, 51 MSC lines were isolated from different parts of 26 UC and successfully expanded in fetal bovine serum (FBS)-containing medium. These cells complied with the criteria for MSC classification as they were adherent to plastic, capable of multilineage differentiation, and expressed CD73, CD90, CD44 and CD105 while lacking hematopoietc and endothelial markers. Differentiation of the different MSC lines along the osteogenic lineage was variable depending mostly on the tissue source and isolation method. Moreover, osteogenic differentiation could be modulated by selecting for cells with high expression levels of CD105 (Endoglin) or by the co-culture of MSCs with different osteogenic potential. With the aim of establishing xeno-free clinically compatible culture conditions, StemPro MSCs serum free medium (SP-MSC SFM), human platelet lysate (in medium or in plasma), human plasma and AB serum (hABS) were tested. We have observed that only hABS supplemented medium could efficiently sustain MSC expansion, morphology, immunophenotype and multi-lineage differentiation similarly to FBS-containing medium. Finally, preliminary data indicates that frozen immunologically inert amniotic membrane is a suitable substrate for osteogenic differentiation of MSCs and, therefore, a promising scaffold for producing an osseous matrix for application in regenerative medicine.A medicina regenerativa é uma área em grande expansão que tenta ultrapassar a escassez e curto tempo de vida dos órgãos e tecidos doados para transplantação e os problemas decorrentes da histocompatibilidade (Chai e Leong 2007). Para tal, células estaminais são expandidas e diferenciadas in vitro num sistema de suporte criado artificialmente. As células estaminais têm o potencial de se auto-renovarem por divisão mitótica mantendo a capacidade de se diferenciarem em vários tipos celulares e deste modo de repovoarem um tecido in vivo. As células mesenquimais do estroma (MSCs, “mesenchymal stromal cells”) representam uma população de células estaminais adultas multipotentes de grande interesse de estudo na área da regeneração de tecidos (Kode et al., 2009). Estas células foram inicialmente identificadas como uma população rara de células estaminais não hematopoiéticas presente na medula óssea (Friedenstein et al., 1966; Friedenstein et al., 1987; Kode et al., 2009; Owen e Friedenstein, 1988). Contudo, tem vindo a ser descrito o isolamento destas células de variados tecidos, entre eles o cordão umbilical humano (UC, “umbilical cord”) (Lu et al., 2006; Nekanti et al., 2010; Shetty et al., 2010). O UC é constituído por duas artérias, uma veia, e uma matriz circundante de tecido conectivo designada por geleia de Wharton (WJ “Wharton’s jelly”), composta por células com morfologia fibroblástica e alguns mastócitos numa substância amorfa rica em proteoglicanos, principalmente ácido hialurónico (Can e Karahuseyinoglu, 2007). MSCs foram já isoladas a partir de todos estes constituintes do UC e constituem uma ferramenta promissora em medicina regenerativa, devido à sua fácil aquisição, elevado potencial de expansão e capacidade de se diferenciar em várias linhagens, nomeadamente osteogénica, adipogénica e condrogénica. Em particular, a sua capacidade de diferenciação osteogénica é de grande interesse para a aplicação clínica destas células em reparação óssea. Neste trabalho MSCs foram isoladas de diferentes partes de 26 UCs tendo 51 linhas celulares sido obtidas. Em particular, foram isoladas células da geleia de Wharton periférica (pWJ) e total (tWJ), apenas dos vasos (V-UC), e de todo o cordão (W-UC). Para isto aperfeiçoámos um método composto por uma fragmentação mecânica da WJ, V-UC e W-UC em pequenos pedaços seguida de uma digestão enzimática de 3 a 4 horas com colagenase e hialuronidase, deste modo obtendo um bom equilíbrio entre a dissociação do tecido e a viabilidade celular. Para a obtenção de tWJ-UC e V-UC foi necessário efectuar uma digestão enzimática inicial da parte interna do cordão para permitir a remoção dos vasos. As células isoladas foram então expandidas num meio de cultura composto pelo meio basal Dulbecco's Modified Eagle's Medium F12 (DMEM-F12), glutamina e soro fetal bovino (FBS). Estas células preencheram os critérios de classificação para MSCs estabelecidos pela Sociedade Internacional para a Terapia Celular (ISCT), uma vez que: eram aderentes ao plástico; auto-renovaram-se em cultura ao longo de várias passagens; expressam os marcadores de superfície específicos CD73, CD90, CD44 e CD105, e não marcadores hematopoiéticos nem vasculares como CD45 e CD34; e foram capazes de se diferenciar nas linhagens osteogénica, adipogénica e condrogénica. Com o objectivo de obter condições de cultura compatíveis com uma aplicação clinica, ou seja sem produtos animais tais como o FBS, foram testados como candidatos o meio de cultura comercial StemPro (SP-MSC SFM), lisado de plaquetas humanas (ressuspendidas em meio- hPL ou em plasma-hPLP), plasma humano (hP) e soro AB humano (hABS). Um meio de cultura apropriado para esta aplicação, deverá ser capaz de sustentar a expansão de MSCs mantendo a sua morfologia, fenótipo e o potencial de diferenciação em diferentes linhagens. Neste estudo, o meio de cultura com hPLP, hPL ou hP apenas permitiu a sobrevivência das MSCs por 3 passagens, ainda que usando placas de cultura revestidas com fibronectina humana e adicionado 250μM de ácido ascórbico (asc), condições que deveriam facilitar a expansão de MSCs (Choi KM et al., 2008; Potdar e d’Sousa, 2010), como foi possível verificar no meio com FBS. No meio de cultura SP-MSC SFM e no meio suplementado com hSAB foi possível expandir as células durante pelo menos 8 passagens. Contudo, em SP-MSC SFM as células sofreram algumas alterações morfológicas e uma diminuição da expressão de CD105 ao longo do tempo em cultura. Por seu lado, MSCs expandidas em hSAB (um pool de soro humano AB alogénico) exibiram o comportamento desejado uma vez que nem a sua morfologia nem o imunofenótipo foi alterado quando comparado com células em meio com FBS. De grande importância foi também a observação que, enquanto em MSCs expandidas em SP-MSC SFM houve uma redução na capacidade de diferenciação osteogénica das células, em meio com hSAB esta capacidade foi mantida. Bons resultados no uso de hSAB como suplemento do meio de cultura de MSCs tinham já sido documentados em outros estudos (Yamaguchi et al., 2002; Kocaoermer, Kern e Kluter et al., 2007). Para a análise do potencial osteogénico das MSCs foram testados diversos meios basais de cultura (com diferentes concentrações de glucose e aminoácidos) e combinações dos osteoindutores ácido ascórbico, dexametasona e β-glicerofosfato. No entanto, observámos que melhores resultados foram obtidos com o meio de cultura comercial MesenCult osteogenic stimulatory kit. A diferenciação osteogénica das células foi avaliada através da análise da expressão génica, imunofenotipagem por citometria de fluxo, marcação para a actividade da fosfatase alcalina (AP), característica da fase de deposição de matriz orgânica (aproximadamente aos 14 dias de diferenciação), e numa fase mais tardia (de mineralização) pela deposição de cálcio detectada com vermelho de Alizarina ou marcação von Kossa. Assim, foi possível observar que durante a osteogénese há uma diminuição inicial da expressão de CD105, CD73 e de CD90 (tanto RNA como proteína), seguida do aparecimento de fosfatase alcalina e osteocalcina, e finalmente um aumento gradual da deposição de cálcio a partir dos 21 dias de diferenciação. Neste estudo foi observada uma grande variabilidade na capacidade de diferenciação das diferentes linhas de MSCs obtidas. Esta variabilidade parece estar de alguma forma relacionada com o tecido e método de isolamento utilizado. No entanto, outros factores como a densidade celular no início da cultura, o nível de expressão de CD105 e a interacção entre células parecem também ter uma importante influência na aptidão osteogénica das MSCs. Em diversos aspectos deste estudo o antigénio CD105, pareceu ter um papel relevante, uma vez que a diminuição da sua expressão em SP-MSC-SFM parece inibir a osteogenése, e as células seleccionadas para elevados níveis desta proteína provocam o aumento de diferenciação das MSCs. O CD105, ou Endoglina, é uma glicoproteina membranar de tipo I que faz parte do complexo do receptor TGF-β (Barbara et al., 1999; Blanco et al., 2005). Assim, a regulação dos níveis de expressão de CD105 pode estar relacionada com a modelação da sinalização em resposta ao TGF-β e esta pode determinar aspectos cruciais da diferenciação osteogénica. Este aspecto deverá ser alvo de estudos futuros. Outro aspecto importante da diferenciação é a matriz ou substrato onde sobre a qual se encontram as células (Salasznyk et al., 2004; Cool e Nurcombe, 2005; Chastain et al.,2006). Neste estudo propusemos a utilização de membrana amniótica (AM “Amniotic membrane”) como um substrato adequado para promover a diferenciação osteogénica de MSCs, o que ajudaria a ultrapassar a necessidade de dissociação das células e disrupção de uma matriz óssea para transplantação num paciente. Os nossos dados preliminares indicam que a AM congelada imunologicamente inerte é um substrato adequado para diferenciação osteogénica de MSCs, apesar de dificuldades em prevenir o enrolamento e enrugamento da membrana durante a diferenciação e de esta diferenciação ser menos eficiente que a de células cultivadas em plástico. Um outro aspecto interessante foi a detecção de um nível basal de AP em MSCs sobre AM em meio de expansão. Isto sugere que a AM tem propriedades intrínsecas que lhe permitem induzir osteogénese, como sejam factores de crescimento presentes na AM (Koizumi et al., 2000; Valladares et al., 2010). Apesar de estudos adicionais serem necessários de modo a melhorar as condições de cultura das MSCs na AM, este parece ser um substrato promissor para a produção de uma matriz óssea para aplicação em medicina regenerativa
