Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011During the last decade it has become more evident that Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) holds a high genetic diversity throughout its population. Two important biological resources for achieving pneumococcalgenetic plasticity are competence/natural transformation and phage transduction. Both factors strongly contribute to genome modification and have a real impact in the capacity of survival and adaptation of this bacterium. Another important survival skill of the pneumococcus is its ability to form matrix‐enclosed biofilms. These microbial communities guarantee protection from environmental threats such as host immune defenses and antibiotics. Moreover, due to the fact that bacteria are believed to spend most of their lifetime in biofilms and that there is a higher physical proximity of bacteria within these structures, biofilms are probably the prefered stage for the occurrence of genetic exchange between pneumococci. This thesis contributes to a better understanding of the mechanisms that generate pneumococcal genetic diversity and the important bacterial ability to form biofilms. In the pursuit of this goal, two biological conditions were selected: a) prophage carriage and b) pherotype characterization, resulting in three independent studies: i) the study of the impact of prophage spontaneous activation on pneumococcal biofilm formation, ii) a molecular epidemiology study of the distribution of pherotypes and its contribution to pneumococcal genetic differentiation and iii) the study of the influence of pherotypes on pneumococcal biofilm growth and recombination efficiency. The study of the effect of prophage carriage and its spontaneously induced host lysis on pneumococcal biofilms reveal that, although limited phage induction results in the death of their bacterial hosts, the bacterial population as a whole benefits from prophage carriage and an enhancement in biofilm formation is observed. Moreover, this study shows a link between the external DNA (eDNA) that is released to the medium due to bacterial lysis and the growth of pneumococcal biofilms. The molecular epidemiology study performed showed that of the two dominants pherotypes (CSP1 and CSP2) the majority of the invasive isolates screened presented the CSP1 pherotype. Several associations with the pherotypes and other biological markers were observed indicating that pherotypes are not randomly distributed within the pneumococcal population. Associations with serotype, antimicrobial resistance and genetic lineage were unveiled; it was also detected that phage transduction may be indirectly arbitrated by pherotypes, implicating an uneven distribution of large genetic elements such as some genetic determinants of antibiotic resistance. The study also showed that strains that are phylogenetically closer have a higher likelihood of sharing the same pherotype. Severe limitations to inter‐pherotype communication may be leading towards an ongoing genetic drift, explaining the two genetically distinct subpopulations that were detected. Moving forward, we decided to explore the impact of the two major pherotypes on both the capacity to form biofilms and on recombination efficiency. Biofilms of strains presenting CSP1 had increased biofilm mass and were more densely packed. Also, the addition of synthetic cognate CSP amplifies the observed differences in biofilm growth between the pherotypes. The study also revealed that CSP1 strains transform more efficient both in the liquid medium and within the biofilm structure. Taken together this thesis work has shown that genetic exchanges between pneumococcal strains are occurring preferentially between strains sharing the same pherotypes and that the enhancement of biofilm formation detected both by prophage carriage and by CSP signaling have in common the positive impact of DNA release to the extracellular medium resulting from the lysis of a fraction of the bacteria inside the biofilm.A última década assistiu a um aumento das evidências reunidas sobre a elevada diversidade genética existente na população de Streptococcus pneumoniae.A competência associada à transformação natural e a transdução fágica são dois recursos biológicos importantes para a plasticidade genómica do pneumococo. Ambos contribuem de forma signficativa para a modificação genómica e têm um impacto visível na capacidade de adaptação e sobrevivência desta bactéria. Outra estratégia de sobrevivência do pneumococo é a sua capacidade de formação de biofilmes. Estas comunidades bacterianas constituem mecanismos de protecção face a ameaças ambientais tais como os mecanismos de defesa do sistema imunitário do hospedeiro e os antibióticos. Além disso, devido ao facto das bactérias existirem maioritamente sob a forma de biofilmes e de existir uma maior proximidade física entre as bactérias nestas estruturas, os biofilmes são provavelmente o palco principal para a ocorrência das trocas genéticas. Esta tese contribui para um maior conhecimento da relação entre mecanismos geradores de diversidade genética e a capacidade de formação de biofilmes em Streptococcus pneumoniae. Com esse intuito foram seleccionadas duas características biológicas: a) a presença de fagos lisogénicos no genoma bacteriano e b) a diversidade ferotípica, resultando em três estudos independentes: i) o impacto da activação espontânea de fagos lisogénicos na formação de biofilmes pneumocócicos, ii) o estudo de genética de populações sobre a distribuição dos ferótipos e a sua contribuição para a diferenção genética no pneumococo, iii) o estudo da influência dos ferótipos na formação de biofilmes pneumocócicos e na respectiva eficiência de recombinação. O estudo do efeito da presença de fagos lisogénicos no genoma bacteriano e da sua lise espontânea nos biofilmes pneumocócicos mostrou que, apesar da indução fágica resultar na morte das respectivas bactérias hospedeiras, a população bacteriana como um todo beneficia da presença dos fagos lisogénicos observando‐se um aumento na capacidade de formação de biofilmes. Este estudo permitiu ainda mostrar a existência de uma ligação entre a libertação de DNA e o aumento dos biofilmes pneumocócicos. O estudo de genética de populações permitiu mostrar que, de entre os dois ferótipos dominantes no pneumococo (CSP1 e CSP2), a maioria das estirpes invasivas caracterizadas apresenta o ferótipo CSP1. Várias associações entre os ferótipos e outros marcadores biológicos foram identificadas indicando que os ferótipos não estão aleatoriamente distribuídos na população pneumocócica. Foram detectadas associações com o serótipo, a resistência antimicrobiana e a linhagem genética; os dados obtidos sugerem igualmente que a transdução fágica pode ser indirectamente arbitrada pelo ferótipo, implicando uma distribuição heterogénea de elementos genéticos de maior dimensão, como é o caso de alguns determinantes genéticos de resistência antimicrobiana. O estudo permitiu ainda mostrar que estirpes filogeneticamente mais próximas têm uma maior probabilidade de partilhar o mesmo ferótipo. Limitações severas à comunicação entre ferótipos parecem estar a conduzir a população pneumocócica para uma situação de afastamento genético continuado, explicando deste modo as duas populações geneticamente distintas que foram detectadas ao longo deste estudo. No âmbito desta tese foi ainda explorado o impacto dos dois ferótipos dominantes na capacidade de formação de biofilmes e na respectiva eficiência de transformação. As estirpes com CSP1 apresentam biofilmes mais densos e com mais biomassa. Além disso, a adição de CSP sintético respectivo amplifica as diferenças observadas no crescimento dos biofilmes entre ferótipos. Este estudo mostra também que estirpes CSP1 são mais eficientes no processo de transformação em meio líquido e em biofilme. Em conjunto, os resultados obtidos nesta tese mostram que as trocas genéticas entre estirpes pneumocócicas estão a ocorrer preferencialmente entre estirpes que partilham o mesmo ferótipo e que o aumento na formação de biofilme detectado quer como consequência da presença do fago lisógenico quer pela via de sinalização do CSP, têm em comum o impacto positivo da libertação de DNA para o meio extracelular resultante da lise de uma fracção de bactérias dentro do biofilme
