Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012Most described bacteriophages end their replication cycle by lysing their hosts. This characteristic has attracted researchers all over the world aiming to develop new alternatives to fight bacterial infectious diseases. All double stranded DNA phages achieve lysis by synthesizing two essential proteins: an endolysin, a protein with peptidoglycan hydrolase activity, and a holin, a small membrane protein that disrupts the cytoplasmic membrane and allows the access of the endolysin to its target or its activation. Holins have been described as essential to determine the optimum timing of lysis, so that the phage release is productive for phage survival. In addition to the endolysin and holin genes, new genes have been identified in the lysis cassette of bacteriophages that infect Gram-negative bacteria. These genes, exemplified by the λ Rz and Rz1 encoded proteins that compromise the stability of the outer membrane, eliminating the last barrier to the release of the progeny virions. No homologues of Rz/Rz1 genes have been identified in mycobacteriophage genomes. The lytic cassette of mycobacteriophage Ms6, a phage that infects Mycobacterium smegmatis cells, comprises, in addition to an endolysin and a holin, three accessory lysis proteins encoded by genes gp1, gp3 (lysB) and gp5. Despite being classified as Gram-positive bacteria, mycobacteria have a complex cell wall. This cell wall consists of peptidoglycan covalently linked to arabinogalactan, which is in turn esterified to a variety of long chain (C60–C90), α-branched, β-hydroxy fatty acids (mycolic acids). The present work describes the characterization of the protein encoded by the mycobacteriophage Ms6 gene lysB and its role in mycobacteria lysis. A BLAST search within the sequences of protein databases revealed similarities to other putative proteins encoded by mycobacteriophages. After His6-LysB protein production in E. coli, it was possible to test its activity in several lipolytic enzymes substrates. Bioinformatics analysis revealed the presence of a conserved motif (GYSQG), characteristic of enzymes with lipolytic activity. The results show that LysB is indeed a lipolytic enzyme showing higher affinity towards substrates of longer chain length (C16 and C18). It is demonstrated that the natural substrates of LysB are mycobacterial lipids containing mycolic acids and that that its main target is mycolyl-arabinogalactan peptidoglycan complex, as it was shown to release mycolic acids from mAGP. Additionally, LysB is also able to hydrolyze the trehalose 6,6’-dimycolate (TDM) from both fast and slow growing mycobacteria species. Construction of a mycobacteriophage Ms6 ΔlysB demonstrated that the gene product of lysB is nonessential for phage viability, but is involved in the lysis mechanism. Given the complexity of the mycobacterial cell envelope, it is easy to understand why mycobacteriophages have evolved new lysis strategies by acquiring them through their evolution.A maioria dos bacteriófagos descritos na literatura são capazes de terminar um ciclo de replicação lisando as suas células hospedeiras. Esta característica tem atraído os investigadores no sentido de explorar esta propriedade para desenvolver novas alternativas para combater doenças infecciosas de origem bacteriana. Todos os bacteríofagos de cadeia dupla de DNA atingem a lise através da síntese de 2 proteínas essenciais: uma endolisina, uma proteína com actividade de hidrólise, e uma holina. Proteína de pequenas dimensões que destrói a membrana citoplasmática permitindo que a endolisina aceda ao seu substrato ou seja activada. As holinas estão descritas como sendo essenciais para determinar o tempo óptimo da lise, de modo a que a libertação de fagos seja produtiva para a sobrevivência do fago. Para além destas duas proteínas essenciais, têm sido identificados novos genes nas cassetes de lise de bacteriófagos que infectam bactérias Gram-negativa. Estes genes, exemplificados pelas proteínas Rz e Rz1 codificadas pelo bacteriófago λ, comprometem a estabilidade das proteínas da membrana externa, eliminando a última barreira para a libertação dos viriões produzidos. Até à data nunca foram identificados homólogos destes genes em micobacteriófagos. A cassete lítica do micobacteriófago Ms6, fago que infecta Mycobacterium smegmatis, para além de codificar as duas proteínas essenciais, compreende três proteínas acessórias à lise codificadas pelos genes gp1, gp3 (lysB) e gp5, restritos aos micobacterófagos. Apesar de serem classificadas com bactérias Gram-positivas, as micobactérias apresentam uma parede celular complexa. Esta parede celular consiste num peptidoglicano ligado covalentemente ao arabinogalactano, que por sua vez se encontra esterificado a uma variedade de ácidos gordos de cadeia longa (ácidos micólicos). - A presente dissertação caracteriza a proteína codificada pelo gene lysB do micobacteriófago Ms6 e o seu papel durante a lise. A análise bioinformática revelou a presença de um motivo conservado (GYSQG), característico de enzimas com actividade lipolítica. Usando a sequência de aminoácidos de LysB, foi realizada uma procura de similaridades nas bases de dados, através do programa BLAST, que identificou um grande número de proteínas similares. Após produção de uma proteína recombinante, His6-LysB, em E. coli foi possível testar a sua actividade em diferentes substratos de enzimas lipolíticas. Os resultados demonstraram que LysB apresenta uma maior afinidade para substratos de cadeia longa (C16 e C18). Foi possível demonstrar que o alvo de Ms6 LysB é a membrana externa de Mycobacterium smegamtis, ao clivar a ligação ester que liga os ácidos micólicos ao arabinogalactano no complexo micolil-arabinogalactano peptidoglicano. No entanto este substracto não é único uma vez que LysB também é capaz de hidrolisar o 6,6’-trealose dimicolato (TDM) de diferentes espécies de micobactérias. A construção de um micobacteriófago delecionado no gene lysB, demonstrou que o produto deste gene não é essencial - xv - para a viabilidade do fago, mas participa no mecanismo de lise. Tendo em conta a complexidade do envelope das micobactérias, é fácil entender a necessidade dos micobacteriófagos adquirirem, durante a sua evolução, genes que lhes conferem uma vantagem evolutiva sobre aqueles que não os adquiriram de modo a conseguirem atingir uma lise mais rápida e eficiente.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/29167/2006, PTDC/SAL-FCF/73017/2006
