Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011The digestive tract is constantly in contact with several microorganisms that constitute the gut microbiota. The crucial role this microbial community, both in mammals and in insects, plays in the host physiology is starting to be revealed. The microbiota affects the host nutrition, developmental process and immune system. We can discriminate between two types of microorganisms inside the gut: indigenous microorganisms that colonize the host and transient microorganisms that are acquired from the environment and food. Insects that are found in the nature and reared under laboratory conditions may present differences in the gut microbiota composition. This has also been reported in Drosophila melanogaster, where it is still not clear whether the flora found in the digestive tract establishes a symbiotic relationship with the host or if it is continuously loaded with the ingested food. Here, we attempt to characterize the microbial community and its stability inside the gut of Drosophila melanogaster, both reared under laboratory conditions and collected from nature. We observe more diversity in wild caught flies, compared with laboratory flies. We show that the microbiota of laboratory-reared flies’ guts is not stable and almost disappears when flies are fed with sterile food. Moreover, we show that these bacteria grow on the flies’ food. In contrast, wild caught flies microbiota is able to persist inside the gut, even when flies were fed with sterile food. Conditions were established to rear axenic flies in order to perform future infections with wild caught flies gut microbiota, to understand if the ability to persist inside the host is due to the microbiota composition that is found in the wild. We show the importance of identifying the indigenous microbial flora present inside the gut, before start studying the microbiota role in the host. This study will pave the way to future research on gut symbionts of insects.Todos os Eucariotas vivem num íntima associação com variados microrganismos. Tradicionalmente estes microrganismos eram denominados por comensais, pois pensava-se que apenas estes beneficiavam desta associação, desconhecendo-se possíveis efeitos no hospedeiro. Contudo, muitos estudos têm vindo a mostrar que a comunidade microbiana é vantajosa em diversos aspectos da fisiologia do hospedeiro, tal como na nutrição, no processo do desenvolvimento e no sistema imunitário. Desta forma, a palavra comensalismo têm vindo a ser substituída por mutualismo, pois hoje sabe-se que ambos beneficiam desta associação. Um dos papéis mais importantes que a comunidade microbiana desempenha no hospedeiro é no seu sistema imunitário. A flora protege da colonização de patogéneos externos, limitando a sua proliferação no intestino. Também está envolvida em activar o sistema imune a níveis basais, tornando o hospedeiro apto para lidar contra infecções. Vários estudos também têm mostrado a importância da flora a nível do desenvolvimento das próprias células do sistema imune. São escassos os estudos em Drosophila melanogaster que tentam compreender o papel dos microbiota no sistema imunitário. Em 2008, Ryu e colaboradores mostraram a importância da flora na activação de níveis basais deste sistema. Este estudo também mostra a importância da regulação do sistema imunitário e o seu efeito na composição da flora intestinal. Para que se possa estabelecer uma relação com os microrganismos é necessário que, os níveis do sistema imunitário do hospedeiro se mantenham baixos, a fim de não os expulsar. Este estudo mostrou que quando o sistema imune era desregulado, havia uma espécie de bactéria presente na flora do hospedeiro que desaparecia, que era importante na inibição da proliferação de uma espécie patogénica. Como consequência, a espécie patogénica que também se encontrava presente na flora, proliferava e comprometia a sobrevivência do hospedeiro. A flora intestinal também desempenha um papel muito importante na nutrição do hospedeiro, ajudando a degradar certos compostos e a produzir algumas moléculas e enzimas que o hospedeiro, por si só, não consegue produzir. Um estudo recente em Drosophila melanogaster mostrou a importância da flora intestinal na nutrição. Quando moscas axénicas (livres de quaisquer microrganimos) se encontravam num meio de comida que não era muito rico em nutrientes, o seu desenvolvimento era afectado, tendo as larvas um tamanho abaixo do normal. Pelo contrario, quando as moscas tinham a flora normal, mesmo num meio de comida pobre, o seu desenvolvimento era normal. Isto demonstrou que mesmo num meio escasso em nutrientes, as bactérias presentes na flora ajudam a um correcto desenvolvimento do hospedeiro. A composição da flora presente no intestino também é afectada pela dieta do hospedeiro. Um estudo em humanos que sofriam de obesidade, demonstrou que quando estes eram sujeitos a uma dieta saudável, havia uma mudança nas bactérias que eram dominantes, havendo um aumento das bactérias do género Bacteroidetes e uma diminuição do género Firmicutes. Em Drosophila melanogaster também foi mostrado em laboratório, que quando estas eram sujeitas a uma dieta diferente, havia uma mudança na relativa abundância de bactérias presentes na flora. Vários estudos têm demonstrado que insectos encontrados na natureza e mantidos em laboratório apresentam floras diferentes. Em Drosophila melanogaster estudos recentes também já demonstraram o mesmo, nomeadamente que as moscas que são mantidas em laboratório, apresentam uma grande falta de diversidade quando comparadas com moscas selvagens. Quando se estudam os microrganismos presentes no intestino, podemos encontrar também microrganismos que não estão a colonizar o hospedeiro, mas que se encontram presentes pois foram adquiridos do ambiente ou da comida ingerida. São denominados por microrganismos transientes, pois estão só de passagem no tracto intestinal, juntamente com a comida. Por outro lado temos os microrganismos indígenas, que colonizam e proliferam no hospedeiro. A maior parte dos estudos não tem a preocupação de distinguir entre estes dois tipos de microrganismos, o que pode levar a variabilidade entre resultados ou mesmo a malinterpretações. Este estudo tenta fazer uma melhor caracterização da flora em Drosophila melanogaster, em moscas selvagens que foram apanhadas na natureza e em moscas que são mantidas em laboratório. Tentou-se também compreender a estabilidade da flora no sistema digestivo, quer nas moscas selvagens quer nas de laboratório, tentando fazer-se uma distinção entre bactérias transientes e bactérias indígenas. Verificou-se que as moscas selvagens apresentam mais diversidade e maior número de bactérias, quando comparadas com as moscas de laboratório. Isto deve-se provavelmente ao tipo de dieta e ao ambiente que as rodeia. Na natureza, há uma grande quantidade de microrganismos presentes e a dieta apresenta-se muito mais rica e diversa. Pelo contrário, em laboratório, as condições em que as moscas são mantidas são mais assépticas do que na natureza, e apenas um tipo de comida é administrado. Para se compreender a estabilidade da flora, desenvolveu-se um protocolo em que se administrava às moscas comida estéril, evitando a reinfecção de possíveis bactérias transientes. Verificou-se que as moscas do laboratório perderam quase por completo toda a flora com este protocolo, ao contrário das moscas selvagens, em que grande parte da flora conseguiu persistir no sistema digestivo. Também se verificou que as bactérias encontradas no interior do sistema digestivo das moscas de laboratório conseguem crescer na comida que é administrada. Estes resultados demonstram que as moscas de laboratório apresentam uma flora instável, a qual é constituída por muitas bactérias transientes que crescem na comida e desaparecem do sistema digestivo quando é evitada a reinfecção das moscas com a sua própria flora. O mesmo não acontece nas moscas selvagens, que demonstram manter uma população mais estável no sistema digestivo. Moscas de laboratório foram desenvolvidas axénicas, com o objectivo futuro de transferir a flora presente nas moscas selvagens que se manteve estável até ao fim para estas moscas. Deste modo, se a flora das moscas selvagens depois de transferida para moscas de laboratório for capaz de persistir, esta colonização pode ser devido às bactérias que são diferentes ou mesmo ao seu comportamento que é diferente, como por exemplo a capacidade de formar biofilmes para poderem colonizar no hospedeiro. Para finalizar, este estudo demonstra a importância de se estudar a estabilidade da flora e de ter em conta se existem microrganismos transientes, antes de começar qualquer estudo sobre a influência da flora no hospedeiro. Caso contrário, podem originar-se conclusões erradas e variabilidade nos resultados, dependendo de como se mantêm as moscas em laboratório. É importante proceder primeiro a uma caracterização da flora, verificar se é representativa da flora em insectos presentes na natureza, e só depois estudar o seu papel
