Tese de doutoramento, Biologia (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Upon hydration in a simple medium, pollen grains germinate and develop a cytoplasmic extension designated as the pollen tube, the growth rate of which can reach up to 4 μm s-1, making it one of the fastest polarized cellular growths in nature. This apical growth is oscillatory and its control has been systematically shown to be underlined by ion dynamics, namely ion fluxes across the membrane and cytoplasmatic ionic gradients. These phenomena were identified and characterized by means of imaging techniques and by Self Referencing Vibrating Probes. Thus far the ions known to be involved are Chloride (Cl-), Calcium (Ca2+), Proton (H+) and Potassium (K+), which apical fluxes oscillate with the same frequency as that of the apical growth.
Zonia et al. (2002) identified and characterized the Cl- fluxes in growing pollen tubes from two species, Lilium longiflorum and Nicotiana tabacum, showing that this ion leaves the pollen tube through an oscillating efflux at the tip and enters through a non-oscillating influx at the shank of the tube, starting at approximately 15 μm from the tip. These authors also associated the efflux of Cl- to the Ins(3,4,5,6)P4 (Inositol 3,4,5,6 tetra-kis-phosphate) signaling pathway. This compound, known for inhibiting receptor mediated Ca2+ dependent Cl- currents, inhibited the pollen tube growth, induced the increase of the cellular volume and compromised the normal efflux of Cl-. Other inhibitors were also tested: DIDS (4,4'-di-iso-tiocianate-stilbeno-2,2'-disulfonic acid), o NPPB (5-nitro-2-(3-fenil-propil-amino)benzoic acid) and niflumic acid completely inhibited the pollen tube growth, the cytoplasmic streaming and caused the increase of the cellular volume. Nevertheless, only DIDS completely abolished the oscillatory effluxes of Cl-.
Zonia et al. (2002) showed that the Cl- fluxes are essential to the pollen tube growth due to its role in the maintenance of the cellular volume. This observation let to the hypothesis that the fluxes of water through the plasma membrane follow the fluxes of Cl-.
The work developed in this thesis lay with the isolation and characterization of the anionic currents present in the pollen grain protoplasts of two species, Arabidopsis thaliana and Lilium longiflorum. The first species was chosen due to the fact that it is the biological model for plants, endowing it with the necessary molecular tools for the latter identification of the channel or channels responsible for the Cl- fluxes reported in Zonia et al. (2002). The second species was chosen not only because it has been recurrently used as a model in the study of development of pollen tubes, but also because it would allow for a comparison between the same type of currents in two very different species.
The necessity of developing specific protocols for the isolation of the anionic currents in this system stemmed from the fact that, although there was already published reports on anionic currents in plant cell protoplasts, namely from leaf meristem, from stomata and from apical root cells, the existing protocols were inadequate, for producing quality protoplasts and for not allowing the patch clamp technique to be applied. It was necessary to adjust the time of incubation in the enzyme solution, and the time and speed of the centrifugation steps in the protocol for the production and isolation of protoplasts. For the isolation of the anionic currents it was necessary to adjust the osmolarity of the bath and pipette solutions, their ionic content.
The anionic currents found in the plasma membrane of pollen grain protoplasts from Arabidopsis thaliana and Lilium longiflorum were characterized by means of the Whole Cell (WC) configuration of the patch clamp technique, under symmetrical anionic concentrations, in which Cl- was the permeable anion in greater concentration. Under these experimental conditions, it was possible to identify, in the protoplasts of Arabidopsis thaliana, three different anionic current populations, all with a strong outward rectification. These were ICl1 (current lost during rundown, after the establishment of the WC configuration), ICl2 (current insensitive to the inhibitor NPPB), and ICl3 (current inhibited by 100 μM of NPPB). ICl2 and ICl3 were measured after rundown. Despite the strong outward rectification, the putative channels responsible for the detected anionic currents allow the passage of current in both directions (inwardly and outwardly), since both negative and positive currents suffered rundown and were inhibited by NPPB.
The currents presented a time dependent activation for the more positive membrane potentials (Vm), that is, an activation induced by depolarizing Vm. This can be described by three current components, one which is instantaneous - Iinst (sub millisec) and two which are time dependent - I1 e I2, characterized by the time constants 1 (hundreds of millisec) and 2 (tens of millisec), respectively. Using a tail protocol it was possible to observe that these currents are also characterized by a hyperpolarizing time dependent deactivation. The variation of the cord conductance (G) with Vm was also studied, by fitting a Boltzmann equation to the values of G when plotted against Vm. This analysis revealed that ICl1 has a different sensitivity to variation in Vm. By diminishing the Cl- concentration in the bath solution ([Cl-]out) after the rundown, it was possible, not only to confirm the anionic nature of the currents but also to determine that ICl1 and ICl3 are regulated by [Cl-]out. The ionic selectivity of the two populations of currents was studied by replacing part of the [Cl-]out by NO3-. It was possible to conclude that the permeability to NO3- was two times higher than to Cl- (PNO3-/PCl-).
The effect of three different intracellular calcium concentrations ([Ca2+]in, in the nM, μM and mM range), was studied showing that all three currents increased in intensity with increasing [Ca2+]in, while their sensitivity to NPPB decreased. The sensitivity of G to variations in Vm was not changed.
The populations of anionic currents - ICl1, ICl2 and ICl3 – with very similar characteristics were also found in pollen grain protoplasts from Lilium longiflorum. These differed, not only in the response to [Ca2+]in, but also in the sensitivity to NPPB, which was inferior, since the minimal NPPB concentration needed was 500 μM. Other differences laid with the PNO3-/PCl-, which in these currents was 1.2, and with the fact that these were not regulated by [Cl-]out.
From the values of the currents it was possible to calculate the anionic fluxes that these could originate. By varying the Vm and [Ca2+]in is was possible to oscillate the values of the calculated fluxes in a manner compatible with the observed Cl- fluxes reported by Zonia et al. (2002) in growing pollen tubes from Lilium longiflorum. It was not possible to perform the same comparison for Arabidopsis thaliana, since the Cl- fluxes in growing pollen tubes haven’t been characterized in this species yet. Nevertheless it is possible to claim with some level of confidence that the anionic currents here described can be responsible for the observed fluxes.
The identification of the channel or channels responsible for the observed anionic currents was also attempted. Through the analysis of the pollen grain transcriptomic it was possible to isolate the following gene candidates: CLC-c, CLC-d, MSL10, ALMT12, SLAH2, SLAH3 and CaCC. The first two genes, CLC-c and CLC-d, were eliminated in a second selection phase, not only because they were both localized in intracellular membranes, namely the tonoplast and the trans-Golgi network, but also because all the CLC channels so far characterized revealed themselves as anion:H+ cotransporters. MSL10 was also eliminated because these channels aren’t regulated by cytoplasmic Ca2+ or by Vm. ALMT12 was eliminated because, unlike the currents elicited by this channel, the anionic currents described here suffered a decrease in intensity when 5 mM of malate was added to the bath solution, indicating a smaller permeability to this anion. The candidates SLAH2 and SLAH3, homologues of SLAC1, were not selected because they have yet to be electrophysiologically characterized. The best candidate was CaCC, since the currents in the animal homologues have been characterized, revealing themselves very similar to the ones described in this thesis. Unfortunately it was impossible to confirm this identification due to a lack of a true KO mutant for this gene.Ao germinar, o grão de pólen forma uma extensão citoplasmática designada por tubo polínico, cujo crescimento é polarizado e apical, podendo atingir os 4 μm s-1. Este crescimento distingue-se por ser oscilatório e por estar intimamente associado a fluxos iónicos através da membrana plasmática e aos gradientes citoplasmáticos que os fluxos originam. Estes fenómenos foram identificados e caracterizados através de técnicas de Imagiologia e de Sondas Vibráteis Auto Referenciáveis. Até à data os iões que se sabem estar envolvidos são o Cloreto (Cl-), Cálcio (Ca2+), Protão (H+) e Potássio (K+), cujos fluxos apicais oscilam com a mesma frequência que o crescimento.
Zonia e colaboradores (2002) identificaram e caracterizaram os fluxos de Cl- em tubos polínicos de duas espécies, Lilium longiflorum e Nicotiana tabacum, mostrando que este ião sai do tubo polínico através de um efluxo oscilante no ápice e entra através de um influxo não oscilante nos lados do tubo, e que tem inicio a aproximadamente 15 μm da ponta. Estes autores associaram o efluxo de Cl- à via de sinalização do Ins(3,4,5,6)P4 (Inositol 3,4,5,6 tetra-kis-fosfato). Este composto, conhecido por inibir correntes de Cl- dependentes de Ca2+ e mediadas por receptores, inibiu o crescimento do tubo polínico, induziu o aumento do volume celular e comprometeu o normal efluxo de Cl-. Outros inibidores de correntes aniónicas também foram testados: o DIDS (ácido 4,4'-di-iso-tiocianato-stilbeno-2,2'-disulfónico), o NPPB (ácido 5-nitro-2-(3-fenil-propil-amino)benzóico) e o ácido niflúmico inibiram completamente o crescimento do tubo polínico, o streaming citoplasmático e causaram o aumento do volume celular. No entanto, apenas o DIDS conseguiu destruir os efluxos oscilatórios de cloreto.
Com este artigo, Zonia e colaboradores (2002) mostraram que os fluxos de Cl- são essenciais ao crescimento do tubo devido ao seu papel na manutenção do volume celular. Esta observação levou à hipótese de que os fluxos de água através da membrana plasmática seguiam os fluxos de Cl-.
O trabalho desenvolvido durante o meu doutoramento e que conduziu a esta tese prendeu-se com o isolamento e a caracterização das correntes aniónicas em protoplastos de grão de pólen de duas espécies, a Arabidopsis thaliana e o Lilium longiflorum. A primeira espécie foi escolhida por ser o modelo biológico das plantas e por possuir as ferramentas moleculares necessárias à identificação dos possíveis canais responsáveis pelos fluxos de Cl- descritos por Zonia e colaboradores (2002). A segunda espécie foi escolhida não só por ser um modelo recorrentemente utilizado no estudo do desenvolvimento em tubos polínicos, mas também por permitir uma comparação entre o mesmo tipo de correntes em duas espécies tão distintas.
A necessidade de desenvolver protocolos específicos para o isolamento das correntes aniónicas neste sistema surgiu do facto de, apesar de já se ter estudado correntes aniónicas em protoplastos de células vegetais, nomeadamente do meristema da folha, dos estomas e da raiz apical, os protocolos existentes eram desadequados, quer por não produzirem protoplastos de qualidade, quer por impedirem a aplicação da técnica de patch clamp. No protocolo para a produção e isolamento de protoplastos foi necessário ajustar os tempos de incubação na solução enzimática e a velocidade e tempo de centrifugação. Para o isolamento das correntes aniónicas foi necessário ajustar a osmolaridade das soluções de banho e de pipeta, ajustar as concentrações dos iões em solução.
As correntes aniónicas presentes na membrana plasmática dos protoplastos de grãos de pólen de Arabidopsis thaliana e Lilium longiflorum foram caracterizadas na configuração de célula inteira (Whole-Cell, WC) da técnica de retalho controlado (patch clamp), sob condições simétricas de concentração aniónica, sendo o Cl-, o ião permeável presente em maior quantidade. Nestas condições experimentais foram identificadas nos protoplastos de Arabidopsis thaliana três populações diferentes de correntes aniónicas, todas com rectificação positiva: ICl1 (corrente perdida por rundown depois da entrada em WC – diluição de factores intracelulares para a pipeta por difusão), ICl2 (corrente insensível a NPPB), e ICl3 (corrente inibida por 100 μM de NPPB). ICl2 e ICl3 foram medidas depois do rundown. Apesar da forte rectificação outward, os possíveis canais responsáveis pelas correntes aniónicas detectadas permitem a passagem de corrente em ambas as direcções (inward e outward), já que quer as correntes positivas, quer as negativas sofrem perda de intensidade por rundown e são inibidas por NPPB.
As correntes apresentam também uma activação dependente do tempo para os potenciais de membrana (Vm) mais positivos, isto é, induzida por potenciais de membrana (Vm) depolarizantes, podendo esta ser descrita com três componentes, uma instantânea - Iinst (sub milissegundos) e duas dependentes do tempo - I1 e I2, caracterizadas pelas constantes 1 (centenas de milissegundos) e 2 (dezenas de milissegundos), respectivamente. Utilizando um protocolo de cauda, foi possível observar que estas correntes sofrem também uma desactivação dependente do tempo, desta vez induzida por Vm hiperpolarizantes.
A variação da condutância corda (G) destas correntes com Vm também foi estudada. Aos resultados obtidos foi ajustada uma equação de Boltzmann, cujos parâmetros demonstraram uma sensibilidade diferente de ICl1 a variações no Vm. Diminuindo a concentração de Cl- na solução de banho ([Cl-]out), depois de o rundown terminar, permitiu descobrir que as populações ICl2 e ICl3 são reguladas por [Cl-]out. A selectividade iónica das populações ICl2 e ICl3 foi estudada através da substituição de parte da [Cl-] na solução de banho por NO3-, chegando-se à conclusão que a permeabilidade ao NO3- era duas vezes maior que a permeabilidade ao Cl- (PNO3-/PCl-).
Foi também averiguado o efeito de três concentrações intracelulares de cálcio diferentes ([Ca2+]in, na gama de nM, μM e mM), mostrando que as três diferentes populações de correntes viram a sua intensidade aumentar com o aumento de [Ca2+]in, enquanto a sensibilidade ao NPPB diminuía. A sensibilidade da condutância corda a variações do Vm não se modificou.
Três populações de correntes aniónicas - ICl1, ICl2 e ICl3 - com características semelhantes foram medidas em protoplastos de grãos de pólen de Lilium longiflorum. Estas diferiram não só na resposta ao [Ca2+]in mas também na sensibilidade ao NPPB, que era inferior, já que a concentração mínima de NPPB necessária foi de 500 μM. Outras diferenças prenderam-se com PNO3-/PCl-, que no caso destas populações de correntes foi de 1.2, e com o facto de estas não serem reguladas por [Cl-]out.
A partir dos valores das correntes foi possível calcular os fluxos aniónicos que estas poderiam originar. Fazendo variar o Vm e a [Ca2+]in foi possível fazer oscilar os valores dos fluxos calculados de forma compatível com os fluxos de Cl- descritos em tubos polínicos em crescimento de Lilium longiflorum. Não foi possível realizar a mesma comparação para a Arabidopsis thaliana, uma vez que os fluxos de Cl- ainda não foram descritos para esta espécie. Apesar disso é possível afirmar com alguma segurança que as correntes aniónicas aqui descritas podem ser responsáveis pelos fluxos observados.
Durante o meu doutoramento também foi realizada uma tentativa de identificar o canal ou canais responsáveis pelas correntes observadas. Através da análise transcriptómica dos grãos de pólen de Arabidopsis foi possível isolar numa primeira fase os seguintes candidatos: CLC-c, CLC-d, MSL10, ALMT12, SLAH2, SLAH3 e CaCC. Os dois primeiros candidatos, CLC-c e CLC-d, foram eliminados numa segunda fase, não só por terem sido localizados em membranas intracelulares, nomeadamente no tonoplasto e nas vesículas trans-Golgianas, mas também porque até à data os CLC caracterizados revelaram-se cotransportadores anião:H+. O MSL10 foi eliminado uma vez que estes canais não são regulados pelo Ca2+ citosólico ou pela voltagem. O ALMT12 foi eliminado como candidato pois, ao se adicionar 5mM de malato às correntes aniónicas encontradas nos protoplastos de grãos de pólen de Arabidopsis thaliana, estas sofreram uma diminuição na sua intensidade, indicando que estes canais são menos permeáveis ao malato, ao contrário dos ALMT12. Os possíveis canais SLAH2 e SLAH3, homólogos ao canal SLAC1, acabaram por não ser escolhidos uma vez que os respectivos canais ainda não foram caracterizados. O candidato que se revelou ser o melhor foi o CaCC, uma vez que as correntes dos homólogos em animais já foram caracterizadas, tendo-se revelado muito semelhantes às descritas nesta tese. Infelizmente foi impossível confirmar esta identificação devido à falta de um verdadeiro mutante KO para o gene em questão.Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, SFRH/BD/27399/2006
