Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010As infecções fúngicas invasivas provocadas por Candida spp. constituem uma importante causa de morbilidade e mortalidade em doentes críticos. Apesar de actualmente estarem disponíveis novos fármacos, como as equinocandinas e os azoles de espectro alargado, que aumentaram as opções terapeuticas, a resistência em ambos os grupos tem sido reportada. A associação de antifúngicos com diferentes mecanismos de acção tem sido utilizada como terapêutica de salvamento, mesmo sem a existência de suporte científico. Os estudos para avaliação destas associações sao escassos, as metodologias propostas sao trabalhosas e morosas e os resultados sao por vezes contraditorios. Neste trabalho, e proposto um protocolo citometrico para avaliar o efeito das associações equinocandinas/anfotericina B e equinocandinas/azoles, sobre espécies de Candida. A susceptibilidade aos antifúngicos, isolados e em associação, foi determinada com recurso a dois marcadores fluorescentes: DiBAC4(3) (anidulafungina/anfotericina B) e FUN-1 (anidulafungina/fluconazole). A soma das razões entre a intensidade de fluorescência das células tratadas com os antifúngicos em associação e a intensidade de fluorescência das células tratadas com o antifúngico isolado, resultou num Índice de fluorescência (IF). Pela correlação com o método clássico foi possível classificar a associação como: antagonista quando IF <1, indiferente quando 1≤ IF ≤2, aditiva quando 2< IF <4 e sinérgica quando IF ≥4. Esta metodologia mostrou uma correlação estatisticamente significativa com os métodos clássicos: checkerboard e determinação de unidades formadoras de colónias. Adicionalmente, revelou ser uma técnica simples e rápida, de elevada sensibilidade e especificidade para detecção de efeitos sinérgicos e antagonistas, mostrando-se uma excelente alternativa no estudo de associações entre antifúngicos. Os casos de antagonismo foram raros, mas o facto de poderem ocorrer independentemente da espécie levam a recomendação da sua avaliação in vitro, previamente a sua prescrição clínica. Assim, encontra-se disponível um novo método para avaliação das associações entre antifúngicos, representando um avanço significativo relativamente às metodologias existentes.Invasive fungal infections caused by Candida spp. represent an important cause of morbidity and mortality in critically ill patients. Although at present novel drugs, such as echinocandins and extended-spectrum azoles, have widened the range of available therapeutic options, resistance to both these groups has been reported. The combination of drugs with different mechanisms of action emerged as a salvage therapy, even though the lack of scientific support. Studies validating such combinations are scarce, and the methods of assessment are laborious, time-consuming, and often provide contradictory results. In the present study a flow cytometric protocol is proposed to evaluate the effect of the combination of echinocandins/amphotericin B and echinocandins/azoles, upon Candida species. The susceptibility to either isolated or combinated antifungals was determined by flow cytometry using two fluorescent markers: DiBAC4(3) (anidulafungin/amphotericin B) and FUN- 1 (anidulafungin/fluconazole). An Index of fluorescence (IF) was calculated, as the sum of ratios between the fluorescence of treated cells with the association of antifungals and the fluorescence of cells treated with each individual antifungal. Comparing to classic method it was possible to categorize the association as antagonistic when IF <1, indifferent when 1≤ IF ≤2, additive when 2< IF <4 and synergic when IF ≥4. This methodology showed an excellent correlation with the classic methods namely, checkerboard assay and the determination of colony forming units. Furthermore, it is a simple and relatively fast assay, providing high sensitivity and specificity for the detection of synergic and antagonistic effects, representing an excellent alternative to assess the effect of antifungal associations. Although antagonism was rarely observed, it may occur independently of species. Therefore it is recommended that antifungal combinations should be evaluated before its clinical use. In conclusion, a new approach is now available for evaluating antifungal combinations, which represents a considerable advance to the classic methodologies
