Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008A proteína PIN6 é um dos membros menos caracterizados da família de proteínas PIN, associadas ao transporte de auxina em Arabidopsis thaliana. Nesta planta modelo, o transporte polar auxínico tem sido associado a diversos processos fisiológicos. Por exemplo, o movimento acropetal de IAA, do caule para a raíz, tem sido implicado no desenvolvimento de raízes laterais, enquanto que o movimento basipetal de IAA, do ápice radicular para a junção caule-raíz, tem sido associado à resposta à gravidade. As proteínas PIN desempenham um papel crucial no transporte polar auxínico e desta forma medeiam o estabelecimento e manutenção de meristemas, a iniciação e posicionamento de órgãos laterais, a formação do tecido vascular e as diversas formas de tropismo. Neste trabalho procedeu-se ao estudo da função do gene PIN6 recorrendo a diversas técnicas de engenharia genética e de biologia molecular. O gene PIN6 apresenta níveis de expressão génica relativamente baixos e específicos, sendo detectado apenas em determinadas células e em etapas específicas do desenvolvimento vegetal. O PIN6 é expresso durante a formação de raízes laterais desde a fase de iniciação da raíz, quando as células do periciclo, nos vasos condutores, são activadas para entrarem em divisão celular, até fases mais tardias, como a da emergência da raíz lateral. Na fase de indução de raízes laterais o gene PIN6 encontra-se a marcar as células fundadoras da futura raíz lateral no periciclo. Numa fase posterior, de emergência das raízes laterais, PIN6 é expresso nas margens da raíz lateral, na zona de contacto com a raíz principal, formando uma estrutura em forma de anel. O PIN6 está, ainda, presente no meristema apical caulinar, em domínios restritos localizados sob os locais de formação de novos órgãos e nos vasos condutores dos mesmos. Este gene parece estar maioritariamente relaccionado com o desenvolvimento de novos órgãos laterais ao nível dos meristemas. Os avanços recentes ao nível da Biologia disponibilizaram uma elevada diversidade de estratégias para caracterização funcional de um determinado gene ou família de genes. O recurso a técnicas de genética reversa permite a caracterização funcional de um gene pela determinação do efeitos causados pela sua ausência. Para a caracterização funcional do PIN6 procedeu-se a uma pesquisa de alelos provenientes de colecções de mutantes com inserções de T-DNA. Foram ainda criadas linhas transgénicas com redução dos níveis de expressão do PIN6. Para o efeito, recorreu-se à estratégia de RNA de interferência (RNAi). Os fenótipos das diferentes linhas foram analisados em diversas condições de crescimento. As mutações resultaram em taxas de crescimento da raíz primária superiores e num aumento da produção de raízes laterais em relação às plantas de fenótipo selvagem. Tendo em conta esse fenótipo, a proteína PIN6 é, na generalidade, repressora dos processos de crescimento. O fenótipo dos mutantes pin6 é, ainda, afectado pelo fotoperíodo, uma vez que os fenótipos observados nas plantas crescidas em condições de dia longo foram mais drásticos do que os patentes nas crescidas em presença de luz contínua. Para avaliar uma possível regulação ao nível da percepção da luz, as plantas foram crescidas sob luz contínua com radiações de diferentes comprimento de onda: branco, azul, vermelho, vermelho-longínquo e UV-B. Os mutantes pin6 apresentam maior de-estiolação do hipocótilo sob radiação vermelho-longínqua e UV-B, tendo sido observada uma indução da expressão de PIN6, o que sugere uma interacção, se bem que indirecta, com pigmentos receptores de luz, dos quais se destaca o fitocromo A. Adicionalmente, os mutantes germinaram mais cedo e fazem a transição meristemática da fase vegetativa para a fase reprodutiva antes do fenótipo selvagem, produzindo menos folhas roseta e menos ramificações secundárias nos caules e nas inflorescências. Estes resultados apontam para uma relação estrita entre o PIN6 e genes de identidade dos meristemas vegetativo e floral. Os mutantes pin6 são ainda hipergravitrópicos, sugerindo um papel para PIN6 na percepção da gravidade, provavelmente em conjunto com PIN2. A proteína PIN2 foi já caracterizada como envolvida na resposta à gravidade e o seu gene é expresso juntamente com o PIN6 nos tecidos na raíz. Os níveis de expressão destes dois genes são afectados por alguns factores comuns. Actualmente está disponível uma vasta gama de informação proveniente de experiências de análise de transcritos a larga escala e de pesquisa in vitro de parceiros de interacção, especialmente em Arabidopsis thaliana. Cada vez mais se torna necessário recorrer a estratégias de biologia de sistemas que permitam análises transversais dos resultados obtidos, cruzando dados de fontes diversas para obtenção de informações sobre determinados genes ou processos de interesse. Uma análise in silico dos dados existentes forneceu informação adicional necessária à caracterização do gene PIN6 no que diz respeito à compreensão da sua função e dos mecanismos de regulação que o regem nos processos de desenvolvimento vegetal mencionados, nomeadamente no que diz respeito às respostas a outras hormonas vegetais. Dessa análise concluiu-se que a expressão de PIN6 é afectada a diversos níveis, nomeadamente factores de transcrição para os quais existem elementos reguladores na sequência do promotor de PIN6 e que estão envolvidos na iniciação de fases do desenvolvimento. A nível da iniciação das germinação e desenvolvimento foliar, o PIN6 parece ser induzido pela diminuição dos níveis de LEC1, um factor de transcrição envolvido na dormência e em fases embrionárias do desenvolvimento foliar. MAX4, membro de uma família de genes envolvida na ramificação do caule, parece ser também um repressor da expressão do PIN6, uma relação já descrita para outros genes MAX e PIN. FLC e VIP estão envolvidos no controlo temporal da floração e percepção da vernalização, respectivamente, e interagem um com o outro para promover a iniciação floral estando, possivelmente, envolvidos no controlo da expressão do PIN6. Ao nível da formação de raízes laterais, a proteína PIN6 pode interagir com MDR4, uma proteína envolvida no transporte basipetal auxínico. A sobre-expressão de E2Fa-DPa, um factor de transcrição envolvido na divisão celular e ligado à resposta auxínica, resulta na repressão do PIN6. Adicionalmente, estão presentes no promotor do PIN6 elementos reguladores do ciclo celular, bem como da síntese de componentes da parede celular, sugerindo que a função do PIN6 nas células meristemáticas ocorre principalmente ao nível da divisão celular. As auxinas aumentam os níveis de transcriptos do PIN6 e induzem a sua expressão ectópica em tecidos da raíz. Há evidências desta regulação ocorrer através da via que envolve TIR1-Aux/IAA-ARF e que corresponde à degradação dos repressores Aux/IAAs dependente do proteassoma, libertando os factores de transcrição ARF que, por sua vez, induzem possivelmente a expressão génica do PIN6 . Constata-se a existência de redundância ao nível dos membros da família de proteínas PIN: no mutante pin1 o domínio de expressão do PIN6 expande-se para filas adicionais de células companheiras dos vasos condutores, de modo a equiparar a falta de proteína PIN1 nessas células. Com este trabalho pretendeu-se sugerir hipóteses explicativas dos mecanismos pelos quais PIN6 faz a ligação entre o transporte auxínico e os processos de desenvolvimento em que esta proteína está envolvida, nomeadamente na transição de fase, no estabelecimento e manutenção do meristema apical caulinar, na formação de novos órgãos, folhas e raízes laterais, e na resposta gravirópica. Neste trabalho propõem-se, ainda, estratégias para abordagem dos diferentes pontos que ainda carecem de esclarecimento.PIN6, a member of the PIN protein family of auxin transporters, is expressed in relatively low levels and in particular cells at distinct time points. This gene seems to be mainly involved with new lateral organ development. It is expressed in lateral roots, since early stages when pericycle cells are activated for cell division, and in the shoot apical meristem, in restricted domains directly below sites of new organ formation. Screening for T-DNA insertional mutant alleles and generation of knock- down transgenic lines for PIN6 provided the tools to characterize this gene's function. Phenotypes of those lines were analyzed under different growth conditions and included faster growth rates, longer roots and production of more lateral roots. PIN6 is therefore likely to be a negative regulator of overall growth processes. PIN6 phenotype is regulated by photoperiodism, as phenotypes were more drastic under specific photoperiodic conditions. Furthermore, pin6 mutants germinate and make meristem transition from vegetative to reproductive phase earlier than WT, producing less rosette leaves, less secondary branches and inflorescence stems. These results imply a tight regulation between PIN6 and both vegetative and floral meristem identity genes. In addition, pin6 mutants are hypergravitropic, proposing a role for PIN6 in gravity perception, probably in a concerted fashion with PIN2. Auxin upregulates PIN6 expression levels and induces its ectopic expression in additional root tissues. A certain degree of redundancy exists among PIN protein family members. In fact, in the pin1 mutant PIN6 protein localizes to additional cell files, thus compensating for the absence of PIN1. An additional analysis of in silico available data from microarray experiments provided extra information required to better understand PIN6 function and its regulation, namely by other hormones. Explanations regarding the mechanisms by which PIN6 links auxin transport to developmental processes as phase transition, new lateral organ emergence and gravitropism, are proposed
