Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasVários elementos do mRNA, que actuam em cis, participam na regulação da síntese proteica, incluindo codões AUGs na região líder do transcrito, ou, em alguns casos, grelhas de leitura a estes associadas (upstream open reading frames uORFs). Embora aproximadamente 15% dos mRNAs humanos (principalmente, transcritos codificantes de factores de crescimento ou hormonas) contenham uORFs, na maioria dos casos, o princípio pelo qual a uORF medeia o controlo traducional é pouco compreendido. A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína sintetizada e excretada principalmente pelo rim, cuja função hormonal clássica envolve um papel chave na eritropoiese. No entanto, diversas funções não-hematopoiéticas foram recentemente descritas. Consequentemente, a EPO pode ser utilizada como alvo terapêutico para diversas disfunções humanas. A compreensão dos mecanismos moleculares do controlo traducional do mRNA da EPO pode ser útil na determinação dessas terapias. Sabendo que o transcrito da EPO humana apresenta uma região 5' líder com 181 nucleótidos contendo uma uORF de 14 codões e dado que parece ser conservada entre espécies diferentes, o que parece indicar a sua função na regulação traducional, o objectivo foi investigar esta hipótese. De forma a analisar o efeito desta uORF, as linhas celulares HepG2 e HEK293 foram transfectadas com diversas construções usando o gene repórter da luciferase com a uORF intacta ou inactiva. A actividade da luciferase foi medida por ensaios de luminescência e normalizada aos correspondentes níveis de mRNA para obter as eficiências traducionais. Os níveis de mRNA foram quantificados por RT-PCR quantitativo. Os resultados revelaram que a uORF consegue diminuir a eficiência traducional da ORF principal em cerca de 70%. Adicionalmente, os resultados sustentam a conclusão de que o leaky scanning reconhece o codão AUG principal. Para além disso, a uORF é capaz de responder à falta de nutrientes aumentando a quantidade de proteína produzida, de uma forma específica de tecido.Among the various cis-acting elements in mRNAs that participate in regulating protein synthesis are AUG codons within transcript leaders and, in some cases, associated upstream open reading frames (uORFs). Although about 15% of the human mRNAs (mainly, transcripts encoding growth factors or hormones) present uORFs, for the vast majority of the cases, the principles by which uORFs participate in translational control are still poorly understood. In its classical hormonal role, erythropoietin (EPO) is a glycoprotein synthesized and released mainly from the kidney, which has a key role in hematopoiesis. However, many other non-hematopoietic functions have recently been reported. Consequently, it might be used as a therapeutic target for the treatment of several human disorders. Understanding the molecular mechanisms of translational control of EPO mRNA may be valuable in the determination of these therapies. Knowing that human EPO transcript presents a 5' leader with 181 nucleotides containing a 14-codon-uORF and given that it seems to be conserved among different species, which might indicate its role in translational regulation, we aimed to prove this hypothesis. To analyze the effect of EPO's uORF, HepG2 and HEK293 cells were transfected with several constructs carrying the luciferase reporter gene with the intact or disrupted uORF. Luciferase activity was measured by luminometry and normalized to the corresponding mRNA levels to obtain translation efficiencies. The mRNA levels were quantified by real-time RT-PCR. Results show that the uORF can decrease the main ORF translation efficiency by 70%. In addition, results support the conclusion that the native AUG codon is recognized by leaky scanning. Furthermore, the uORF is able to respond to the lack of nutrients with an increased amount of protein produced, in a tissue-specific way
