Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA Borreliose de Lyme (BL) é uma zoonose de reconhecida importância médica a nível mundial, principalmente no Hemisfério Norte. Esta infecção continua sub-diagnosticada em Portugal devido ao acentuado polimorfismo e à complexa confirmação laboratorial dos agentes causais, espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato. O diagnóstico de BL é essencialmente clínico, baseado nos sinais, sintomas e história de contacto com o vector, sendo complementado por confirmação laboratorial. Este trabalho visou a aplicação de uma abordagem laboratorial polifásica com o fim de pesquisar: i) anticorpos específicos, utilizando um teste de rastreio por imunofluorescência indirecta (IFA - com um conjugado polivalente), e o teste confirmatório western blot (WB-IgM e -IgG); ii) a presença de DNA borreliano pela amplificação, por nested-PCR, do espaço intergénico 5S(rrf)-23S(rrl); e iii) as genoespécies patogénicas de Borrelia por PCR-RFLP. Analisaram-se 166 amostras, 125 de soros e 41 de Líquido cefalo-raquidiano (LCR), de 146 doentes portugueses com suspeita clínica de BL. Por IFA detectou-se reactividade em 61 e 2% das amostras de soro e LCR, respectivamente. De 62 soros reactivos, o WB confirmou 39% (24+/62) como casos positivos (nIgM=9; nIgG=11; nIgM,G=4); de 16 soros não reactivos, o WB revelou como positivos 31% (5+/16) dos casos (nIgM=1; nIgG=3; nIgM,G=1). Do ponto de vista molecular obteve-se DNA borreliano em 20+/125 soros e 5+/41 amostras de LCR, tendo sido identificada a respectiva genoespécie em 88% dos amplicões obtidos com a seguinte distribuição: B. garinii (55%), B afzelii (23%), B. lusitaniae (13%) e B. burgdorferi sensu stricto (9%). Dos 20 doentes considerados positivos por PCR, 12 (60%) foram também positivos por WB. Os resultados moleculares deste estudo enfatizaram a importância da utilização de técnicas baseadas em PCR, a par de uma serologia específica, visando o sucesso do diagnóstico e tratamento clínico de doentes com suspeita clínica de BL, e simultaneamente contribui para o melhor conhecimento da epidemiologia da doença no País.Lyme Borreliosis (LB) is a zoonosis of medical importance recognized worldwide, particularly in the Northern Hemisphere. This infection remains under-diagnosed in Portugal due to the marked polymorphism and complex laboratory confirmation of causative agents, spirochetes of Borrelia burgdorferi sensu lato complex. The diagnosis of LB is essentially clinical, based on signs, symptoms and contact history with the vector, being complemented by laboratory confirmation. This work aimed at the application of a polyphasic laboratory approach, in order to search: i) specific antibodies, using the screening indirect-immunofluorescent assay (IFA with a polyvalent conjugate) and the confirmatory western blotting (WB IgM and IgG); ii) the presence of spirochetal DNA through a nested-PCR targeting the 5S(rrf)-23S(rrl) intergenic spacer; and iii) identification of Borrelia genospecies by PCR-RFLP. A total of 166 samples, 125 sera and 41 Cerebrospinal fluids (CSF) from 146 Portuguese patients with a clinical suspicion of LB was analyzed. The IFA results showed reactivity in 61 and 2%, of sera and CSF samples, respectively. From 62 reactive sera, WB confirmed 39% (24+/62) LB cases (nIgM=9; nIgG=11; nIgM,G=4); from 16 non-reactive sera (IFA), WB detected 31% (5+/16) of positive cases (nIgM=1; nIgG=3; nIgM,G=1). Borrelia DNA was detected in 20+/125 sera and 5+/41 CSF samples, and the genospecies identification was successful in 88% of the amplicons obtained, presenting the following distribution: B. garinii (55%), B. afzelii (23%), B. lusitaniae (13%) and B. burgdorferi sensu stricto (9%). From the 20 positive samples by PCR, 12 (60%) were also positive by WB. The molecular findings seen in this study emphasized the importance of using PCRbased techniques, together with a specific serology, seeking the success of diagnosis and clinical treatment in suspected Lyme Borreliosis patients, while contributing to a better knowledge of the disease's epidemiology in the country
