Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), 2008, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO mecanismo de reparação do DNA após a integração do HIV-1 ainda não foi esclarecido. A cinase dependente de DNA (DNA-PK) já foi descrita como podendo desempenhar um papel importante na integração, contudo existem estudos que contestam tal afirmação. Este trabalho tem como objectivo esclarecer o papel da DNA-PK na replicação do HIV-1. Neste sentido, criaram-se clones onde a subunidade catalítica da DNA-PK (DNA-PKcs) é silenciada pela expressão estável de shRNAs. O nível de silenciamento da DNA-PKcs foi avaliado por Western Blot, verificando-se uma diminuição acentuada dos níveis de expressão de DNA-PKcs para todos os clones. Através destes clones pretendeu avaliar-se a importância da DNA-PKcs para a replicação do HIV-1. Para tal, infectaram-se os clones com HIV-1 e determinou-se a sua resistência à infecção ao fim de sete dias. Todos os clones demonstraram uma inibição quase total de produção de partículas virais e da proteína da cápside (p24), demostrando que a DNA-PKcs é importante para o ciclo de replicação do HIV-1. Uma vez que a DNA-PKcs tem um papel importante na reparação de danos de DNA de cadeia dupla (DSBs), foi avaliado se a infecção com HIV-1 leva à formação de DSBs e se a DNA-PKcs está envolvida na sua reparação. Demonstrou-se que a infecção de HIV-1 leva à fomação de DSBs. Obtiveram-se alguns dados preliminares onde a formação das DSBs devido à infecção com HIV-1 não é tão evidente nos clones que expressam shRNAs contra DNA-PKcs, sugerindo que o papel da DNA-PKcs poderá não ser importante ao nível da reparação das DSBs provocadas pela infecção do HIV-1. O esclarecimento do papel que a DNA-PKcs desempenha na replicação do HIV-1 levará a um maior conhecimento acerca da dinâmica entre o vírus e o hospedeiro, o que poderá levar à descoberta de novos alvos terapêuticos eficazesThe mechanism of DNA repair after HIV-1 integration is yet to be fully understood. The DNA dependent protein kinase (DNA-PK) has been described as possibly having an important role in integration, however there are studies that contradict this statement. The goal of this work is to clarify the role of DNA-PK in HIV-1 replication. For this purpose, clones where the catalytic subunit of the DNA-PK (DNA-PKcs) is silenced by the stable expression of shRNAs were created. The knock down level of DNA-PKcs was evaluated by Western Blot, showing a considerable decrease of DNA-PKcs expression levels in every clone. These clones allow for the study of the importance of DNA-PKcs in HIV-1 replication. To this end, the clones were infected with HIV-1 and their resistance to infection was evaluated after seven days. All clones showed an almost complete inhibition of viral particle and capsid protein (p24) production, showing that DNA-PKcs is important for HIV-1 replication. Since DNA-PKcs has an important role in the repair of DNA double strand breaks (DSBs), it was evaluated if infection with HIV-1 leads to the formation of DSBs and if DNA-PKcs is involved in their repair. It was demonstrated that infection with HIV-1 leads to the formation of DSBs. Some preliminary results show that the formation of DSBs due to HIV-1 infection is not evident in the clones that have stable expression of shRNAs against DNA-PKcs, suggesting that the role of DNA-PKcs in HIV-1 replication might not be important in the repair of DSBs formed during infection. Understanding the role of DNA-PKcs in HIV-1 replication could widen our knowledge on the dynamics between the virus and the host. This could lead to the discovery of novel therapeutic targets effective in the battle against HI
