Hemos generado información genómica aplicable a nuevos métodos de control de la plaga de maíz, Dalbulus maidis (De Long &amp;amp; Wolcott, 1923; Hemíptera, Cicadellidae) vector de Spiroplasma kunkelii, patógeno causante del achaparramiento del maíz. Realizamos el análisis preliminar del transcriptoma y estudiamos los procesos embriológicos del vector con el fin de generar métodos del silenciamiento de genes esenciales para el desarrollo, la fertilidad y la supervivencia

Catalano, M. I.

Dalaisón, L.

Esponda-Behrens, N.

Gazza, E.

González, H.

Palacio, V.

Pascual, A.

Rivera Pomar, Rolando

Undetermined

Centro de Servicios en Gestión de Información

GenóMica y eMbrioloGía de dalbulus Maidis (delonG & wolcott, 1923). (heMiPtera-auchenorrhyncha): nueVos conociMientosPara nueVas herraMientas de controlresuMenHemos generado información genómica aplicable a nuevos métodos de control de la plaga de maíz, Dalbulus maidis (De Long & Wolcott, 1923; Hemíptera, Cicadellidae) vector de Spiroplasma kunkelii, patógeno causante del achaparramiento del maíz. Realizamos el análisis preliminar del transcriptoma y estudiamos los procesos embriológicos del vector con el fin de generar métodos del silenciamiento de genes esenciales para el desarrollo, la fertilidad y la supervivencia. introducciónEl maíz es el segundo de los cereales cultivados en nuestro país. Representa aproximadamente el 25% de los cereales cultivados y un 57,5% de los cereales exportados. Su aporte a la economía Nacional se estima en 8.000 millones de dólares (Eyhérabide, et al., 2009; Ghida-Daza, 2012, 2013) e incrementán-dose. En nuestro país se cultivan 4,26 millones de has de maíz, de las cuales casi el 30% pertenecen a la provincia de Buenos Aires. Entre los problemas fitosanitarios que afectan al cultivo de maíz, se encuen-tran el achaparramiento (corn stunt) y el Mal de Río Cuarto. El primero es producido por tres patógenos que actúan solos o en conjunto: Spiroplasma kunkelii (Corn Sunt Spiroplasma, CSS), el fitoplasma de achaparramiento (Maize Bushy Stunt Phytoplasma, MBSP) y el virus de rayado fino (Maize Rayado Fino Virus, MRFV) (Carpane et al., 2011). Se conocen unas diez especies de auquenorrincos con capaci-dad vectorial para estos patógenos, pero el de mayor importancia es Dalbulus maidis (CSS, MBSM y MRFV). Las pérdidas calculadas por estas enfermedades son muy altas, en especial en el Noroeste de la provincia de Buenos Aires (Eyhérabide, 2007). D. maidis es una especie monófaga que se alimenta de especies del género Zea sp. (Remes-Lenicov & Virla, 1993). Además de su capacidad vectora, genera daños mecánicos, desequilibrio hídrico y aumenta el riesgo de infecciones producidas por hongos. Las oviposiciones se realizan dentro del parénquima foliar. (Virla et al., 1990; Remes-Lenicov & Virla, 1993). El espiroplasma es propagativo persistente, ya que el insecto infectado mantiene su capacidad vectora toda la vida. Alcanza el floema vegetal desde las glándulas salivales de D. maidis mientras se alimenta (Ozbek et al., 2003). La sintomatología del achaparramiento varía según las condiciones climáticas, el cultivar y la presencia de otros patógenos. Incluye, entre otros síntomas, la proliferación de mazorcas pobremente formadas.Centro de Bioinvestigaciones (CEBIO)Expositor: Dr. RIVERA POMAR, RolandoGrupo de trabajo: Lic. M. I. Catalano, Mg. V. Palacio, Lic. L. Dalaisón, Lic. E. Gazza, Ing. Agr. H. González, Lic. A. Pascual, Lic. N. Esponda-Behrensrrivera@unnoba.edu.arLas formas de control consisten en la búsqueda de genotipos tolerantes o resistentes(Giménez-Pecci et al., 1997; Hidalgo et al., 1998) o se recurre al uso de insecticidas. Los insecticidas actúan sobre todos los insectos, afectando también los benéficos, siendo un caso preocupante el de las abejas, ya que Argentina es uno de los principales productores de miel (INTA informa, 2011). El desarrollo de estrategias de control enfocadas a las plagas es de crucial importancia para la sustentabilidad del agroecosistema a mediano y largo plazo. Una estrategia novedosa consiste en la utilización de la interfe-rencia de ARN (ARNi) mediada por una planta que actúa como fuente de ARN de doble cadena (ARNdc) a través de los fluidos vegetales de los que se alimenta el insecto (Baum et al., 2007). Este tipo de control permite actuar exclusivamente sobre la/las especies de interés sin afectar a otras (Whyard et al., 2009). Esta tecnología requiere identificar genes involucrados directamente en la supervivencia y desarrollo de las especies plaga, con el fin de seleccionar entre ellos, los mejores candidatos para desarrollar una variedad de planta transgénica que exprese de manera constitutiva el ARNdc silenciador del gen blanco. Con el fin de desarrollar esta técnica para afectar poblaciones de D. maidis comenzamos el análisis del transcriptoma, identificamos genes que participan en la ovogénsis y el desarrollo embrionario, y analiza-mos la embriología del insecto.Materiales y MétodosMantenimiento de la colonia de Dalbulus maidis. Los insectos fueron mantenidos en el Cen-tro de Bioinvestigaciones  (CEBIO-UNNOBA) en condiciones controladas (24°C, 70-80% de humedad relativa y 16 hs de luz artificial) sobre plantas de maíz sanas. Los huevos se recolectaron del parénquima foliar, se decorionaron química o manualmente, se fijaron en formaldehido 4 y se tiñeron con DAPI para determinar el estadío del desarrollo por microscopía de fluorescencia.Secuenciación y tratamiento de datos. Se extrajo ARN de todos los estadios del ciclo de vida y se secuenció en la plataforma Illumina HiSeq 2500. Los datos crudos fueron procesados con el programa FastQCtoolkit (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) y se ensambló de novo el transcrip-toma usando la herramienta Trinity (Grabherr et al., 2011). La representatividad de los genes codificantes se analizó por el perfil CEG (Core Eukariotyc Genome) y BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs) y los principales genes que actuan durante la embriogenesis se identificaron de acuerdo a Lavore et al. (2015).resultadosUsando tinción fluorescente para ADN, se determinaron los tiempos del desarrollo embrionario a 25°C correlacionándolos con el momento embriológico: a las 12 horas post puesta (hpp) se identificaron las divisiones celulares iniciales; a 18 hpp los núcleos migran hacia la periferia para formar el blastodermo sincicia; a 24 hpp parte de las células del blastodermo migran hacia la región posterior del embrión y forman la banda germinal inicial; entre 48-72 hpp, se inicia la extensión de la banda germinal y formación de segmentos, proceso que se completa a las 96-120 hpp al tiempo que se forman los apéndices. A partir de las 120 hpp se inicia el proceso de katatrepsis, se completa la morfogénesis y la eclosión. Se estableció un sistema de alimentación artificial de adultos de D. maidis con solución coloreada de sacarosa en un tubo plástico cubierto con una tela de poro cerrado y una gota de alimento entre dos membranas de ParafilmTM. Luego de varias horas, se observó la presencia de colorante en todo el insecto, indicando su distribución por todo el organismo a través de la hemolinfa. Este análisis constituye la base operativa de la búsqueda de los genes que interfi eren la fertilidad y la viabilidad de los huevos (revisado en Huvenne y Smagghe, 2010).Se obtuvo el transcriptoma de D. maidis a partir de RNA total de huevos, ninfa I, II, III, IV, V y adultos de ambos sexos. La secuenciación en sistema pair end de 150 nucleótidos proveyó 120 GB de datos crudos (531.787.990 reads). Cada set de datos fue evaluado para ver la calidad de los mismos, se realizó la limpieza por calidad y se eliminaron secuencias adaptadoras. Un resumen se muestra en la Tabla 1.A partir de estos datos se ensambló de novo el transcriptoma usando el software Trinity, obteniéndose valores dentro de lo esperado para una buena secuenciación. La estimación de la cobertura de la secuenciación se determinó en no menos del 90%, alcanzando el 100% en la mayoría de los estadios. Esto indica que se cuenta con una buena cobertura de secuenciación, lo que asegura el éxito en la búsqueda de distintas familias génicas (Figura 2).Con el transcriptoma embrionario ensamblado y con buena cobertura se procedió a la iden-tifi cación de genes involucrados en distintos procesos embrionarios y en la oogénesis. Se utilizó una base de datos correspondiente a Drosophila melanogaster (Lavore et al., 2015) y se determinó la conservación de la mayoría de ellos en el transcriptoma embrionario de D. maidis (Figura 3). Tabla 1. Análisis de las muestras secuenciadas, previo al ensamble. Se indica el número de lecturas (reads) de cada estadio y el número efectivo de lecturas limpias a ensamblarFigura 1. Resultado de la alimentación artifi cial en D. maidisA. Sistema de provisión de alimento coloreadoB. Ejemplar mostrando la distribución de colorante en todo su cuerpo, evidencia de que la alimentacion fue exitosaFigura 2. Cobertura de los transcriptomas correspondientes a los distintos estadíos del ciclo de vida analizados. DMI - DMV, ninfas I a V. Adultos 2 y 3 corresponden a dos muestras independientes de ARN de adultosFigura 3. Conservación de diferentes componentes de vías de señalización de procesos embrionarios y oogénesis en el transcriptoma embrionario de D. maidis. Los genes identifi cados se indican en el textoUn listado parcial de los genes encontrados por similitud y con posible efecto en la forma-ción del huevo o un embrión viable por sus múltiples efectos durante el desarrollo es:Oogénesis, Bazooka, Bicaudal D, Bicaudal C, Egalitarian, Egghead, Exuperantia, Cappuccino, Cornichon, Tudor, Pointed, Singed, Staufen, Mago Nashi, Pumilio, Vasa. Toll-dorsal pathways: Toll, Dorsal, Pelle, Spätzle, Pipe, Gastrulation defective, Nudel, Windbeutel, Tollo, Relish, Short Gastrulation, Twisted gastrulation, Tolloid, Rhomboid, Punt, Medea, Easter. Vías Notch, Wingless y Hedghog: Notch, Delta, Serrate, Suppressor of Hairless, Groucho, Kuzbanian, Neuralized, Deltex, Presenilin, Hedgehog, Smoothened, Fused, Suppressor of Fused, Cubitus interruptus, Wingless, Frizzled, Dishevelled, Armadillo, Shavenbaby, Decapentaplegic, Pangolin, Shaggy, Nemo, Notum, Axin. Vías JAK/STAT: Hopscotch, STAT protein at 92E, Suppressor of variegation 3-9, Suppressor of variegation 205, Ken and barbie, Sex lethal. Desarrollo traqueal: Trachealess, Branchless, Spalt Ventral veins lacking, Thickveins, HIF prolyl hydroxylase, Tango, Pointed, Stumps, Similar, Von hippel lindau, Sprouty, Tramtrack, Dumpy, Escargot, Ribbon, Grainy head.conclusiones y PersPectiVasEn este trabajo se determinó el tiempo de la embriogénesis de D. maidis y se completó el transcriptoma de distintos estadíos del ciclo de vida. Se identificaron genes de desarrollo y se desarrolló un sistema de alimentación in vitro. A partir de la información obtenida, se realizarán las pruebas de ARNi en laboratorio y un estudio comprehensivo de distintos genes interfirientes, para lograr en el mediano plazo, el diseño de plantas transgénicas que puedan afectar la capacidad reproductiva del vector.biblioGrafíaBauM, J.a., Bogaert, t., cLinton, W., heck, g. r.; FeLdMann, p.; iLagan, o.; et al. 2007. Nat Biotechnol 25: 1322–1326.carpane p.; MeLcher u.; Wayadande a.; de La paz giMenez pecci M.; Laguna g.; doLezaL W.; FLetcher J. 2013. 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Genómica y embriología de Dalbulus maidis (Delong & Wolcott, 1923). (Hemiptera-auchenorrhyncha): nuevos conocimientos para nuevas herramientas de control

https://digital.cic.gba.gob.ar/bitstream/handle/11746/8679/1%c2%ba%20Encuentro%20de%20Centros%20CIC_Parte8.pdf-PDFA.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Genómica y embriología de Dalbulus maidis (Delong & Wolcott, 1923). (Hemiptera-auchenorrhyncha): nuevos conocimientos para nuevas herramientas de control

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