Diagnóstico genético de miocardiopatia hipertrófica com recurso a espectrometria de massa com arrays de ADN e desnaturação de alta resolução

Abstract

© Sociedade Portuguesa de CardiologiaHypertrophic cardiomyopathy (HCM), a complex myocardial disorder with an autosomal dominant genetic pattern and prevalence of 1:500, is the most frequent cause of sudden death in apparently healthy young people. The benefits of gene-based diagnosis of HCME for both basic research and clinical medicine are limited by the considerable costs of current genetic testing due to the large number of genes and mutations involved in this pathology. However, coupling two high-throughput techniques--mass spectrometry genotyping (MSG) and high resolution melting (HRM)--is an encouraging new strategy for HCM diagnosis. Our aim was to evaluate the diagnostic efficacy of both techniques in this pathology by studying 13 individuals with a clinical phenotype of HCM. Methods: Peripheral blood samples were collected from: (i) seven subjects with a clinical diagnosis of HCM, all bearing known mutations previously identified by dideoxy sequencing and thus being used as blinded samples (sample type 1); (ii) one individual with a clinical diagnosis of HCM negative for mutations after dideoxy sequencing of the five most common HCM genes, MYH7, MYBPC3, TNNI3, TNNT2 and MYL2 (sample type 2); and (iii) five individuals individual with a clinical diagnosis of HCM who had not previously been genetically studied (sample type 3). Results: The 13 samples were analyzed by MSG for 534 known mutations in 32 genes associated with HCM phenotypes and for all coding regions and exon-intron boundaries of the same HCM genes by HRM. The 32 studied genes include the most frequent HCM-associated sarcomere genes, as well as 27 genes with lower reported HCM phenotype association. This coupled genotyping strategy enabled us to identify a c.128delC (p.A43Vfs165) frame-shift mutation in the CSRP3 gene, a gene not usually studied in current HCM genetics. The heterozygous CSRP3 mutation was found in two patients (sample types 2 and 3) aged 50 and 52 years, respectively, both with diffuse left ventricular hypertrophy. Furthermore, this coupled strategy enabled us to find a novel mutation, c.817C>T (p.Arg273Cys), in MYBPC3 in an individual from sample type 3, subsequently confirmed by dideoxy sequencing. This novel mutation in MYBPC3, not present in 200 chromosomes from 200 healthy individuals, affects a codon known to harbor an HCM-causing mutation – p.Arg253His. Conclusion: In conclusion, in the cohort used in this work coupling two technologies, MSG and HRM, with high sensitivity and low false positive results, enabled rapid, innovative and lowcost genotyping of HCM patients, which may in the short term be suitable for accurate genetic diagnosis of HCM.A Miocardiopatia Hipertrófica (MH), uma doença genética complexa do miocárdio com um padrão de transmissão autossómica dominante e prevalência de 1:500, é a forma mais frequente de morte súbita em jovens aparentemente saudáveis. Os benefícios de um diagnóstico baseado nos genes associados a MH, adequado à investigação básica e à prática clínica, estão, no entanto, limitados pelos consideráveis custos das estratégias actuais de diagnóstico genético, baseadas em sequenciação automática, devido ao elevado número de genes e mutações envolvidas nesta doença. Todavia, consideramos que a conjugação de duas técnicas de elevada resolução – Genotipagem por Espectrometria de Massa (GEM) e Desnaturação de Alta Resolução (DAR) – tem demonstrado ser uma estratégia encorajante para o diagnóstico de MH. Foi nosso objectivo avaliar a eficácia diagnóstica destas duas técnicas no âmbito desta patologia, estudando 13 indivíduos com fenótipo de MH. Neste sentido, foram colhidas amostras de sangue periférico de: (i) sete indivíduos clinicamente diagnosticados com MH, todos com mutações previamente identificadas por sequenciação automática, e actuando como amostras blinded (“amostra tipo 1”); (ii) um indivíduo clinicamente diagnosticado com MH sem mutações identificadas após sequenciação dos 5 principais genes associados a MH, MYH7, MYBPC3, TNNI3,TNNT2 e MYL2 (“amostra tipo 2”); e (iii) cinco indivíduos clinicamente diagnosticados com MH sem estudo genético prévio (“amostra tipo 3”). As 13 amostras foram analisadas por GEM para 534 mutações conhecidas em 32 genes associados a um fenótipo de MH e para todas as regiões codificantes e fronteiras exão/intrão dos mesmos genes por DAR. Estes 32 genes estudados incluem os 5 genes mais frequentemente associados a MH e outros 27 genes reportados como associados a MH numa menor frequência. Esta estratégia permitiu-nos identificar uma mutação c.128delC (p. A43Vfs165) que origina uma alteração na grelha de leitura da proteína codificada pelo gene CSRP3, um gene usualmente não analisado pela estratégia corrente de diagnóstico genético. Esta mutação em heterozigotia no gene CSRP3 foi encontrada em dois doentes (amostra tipo 2 e 3) com 50 e 52 anos respectivamente, e que apresentavam hipertrofia ventricular esquerda difusa. Esta estratégia permitiu-nos ainda identificar uma nova alteração c. C>T817 (p.Arg273Cys) no gene MYBPC3 num indivíduo da amostra tipo 3 que foi posteriormente confirmada por sequenciação. Esta nova alteração no gene MYBPC3, ausente em 200 cromossomas de indivíduos saudáveis, afecta um codão cuja mutação foi já associada a MH – p.Arg253His. Em conclusão, a conjugação de duas tecnologias, GEM e DAR, de elevada sensibilidade e baixo nível de resultados falsos positivos permitiu, na amostragem utilizada neste trabalho, uma genotipagem rápida, inovadora e de baixo custo em doentes com MH, podendo vir a tornar-se a curto prazo numa metodologia apropriada para o diagnóstico genético de MH.info:eu-repo/semantics/publishedVersio