Lee Jeongeun

李 貞恩

Tsukuba Repository

Utilization of High GABA Tomato via
CRISPR/Cas9 for Hybrid Breeding
著者 Lee Jeongeun
発行年 2018
その他のタイトル CRISPR/Cas9により得られたGABA高蓄積トマトの育
種利用に関する研究
学位授与大学 筑波大学 (University of Tsukuba)
学位授与年度 2018
報告番号 12102乙第2875号
URL http://hdl.handle.net/2241/00153777
                                             
 
 
 
   氏名            李 貞恩   
 
   学位の種類          博 士（ 農学 ） 
 
   学位記番号          博 乙 第  ２８７５  号 
 
   学位授与年月日      平成 ３０年 ４月 ３０日 
 
   学位授与の要件      学位規則第４条第２項該当 
 
   審査研究科      生命環境科学研究科 
 
学位論文題目   Utilization of High GABA Tomato via CRISPR/Cas9 for Hybrid Breeding 
（CRISPR/Cas9により得られたGABA高蓄積トマトの育種利用に関する研究） 
 
 
   主査             筑波大学 教授  博士（農学） 江面 浩 
 
   副査       筑波大学 教授  博士（農学） 松倉 千昭 
 
   副査       筑波大学 准教授 博士（理学） 小野 道之 
 
     副査       筑波大学 准教授 博士（農学） 福田 直也 
 
 
               論   文   の   要   旨 
  
審査対象論文は、ゲノム編集技術の一代雑種育種への応用の可能性を検証し、育種学分野への波及効果に
ついて考察を行うものである。 
先行研究では、ゲノム編集技術を利用してγ-アミノ酪酸（GABA）高蓄積を示す 4 つの独立した系統が
実験用矮性品種‘Micro-Tom’にて作出されていた （遺伝型：1塩基挿入型、53塩基欠損型、4塩基欠損型、
6塩基欠損１塩基挿入型）。著者は、これら4つの系統が一代雑種の育種親として利用可能であるか検証した。
一代雑種の育種親として利用する場合、ゲノム編集技術により創出した変異が遺伝的に安定であること、お
よび優性形質として発現することが重要である。そこで、審査対象論文の第一章ではゲノム編集技術で創出
した変異の育種利用に関する課題を俯瞰し、第二章で創出変異の遺伝的安定性を検証し、第三章で優性形質
として発現するかを実証した。 
著者は、先行研究において作出された 4 つの系統の遺伝型をゲノム編集後第 2 世代とゲノム編集後第 3
世代について dCAPS 法とシーケンサー法を用いて解析した。その結果、2 世代にわたり変異が安定して維
持されていることが示された。次に、第 2世代における緑熟果実の GABA合成遺伝子の発現と緑熟果実と赤
熟果実の GABA 含量を調査した。その結果、野生型よりも遺伝子発現が低下する傾向にある一方で、GABA
含量は増加していたことが示された。続いて、第 3世代の赤熟果実における GABA含量も測定した。その結
果、野性型よりも GABA含量が上昇することが示された。最後に、果実の縦径、横径、新鮮重と植物個体の
高さを調査した。第 2 世代と第 3 世代の 1 塩基挿入型、53 塩基欠損型において、野生型よりも果実の横径
と新鮮重がわずかに減少する傾向であったが、果実の縦径および植物個体の高さには有意な差がないことが
示された。4 塩基欠損型、6 塩基欠損１塩基挿入型を持つ系統においては、いずれの形質についても野生型
と同程度であったことが示された。先行研究の結果と本研究の結果を合わせて、著者はゲノム編集後第 3世
代まで変異が安定的に遺伝し、GABA高蓄積の表現型は安定的に現れると評価した。 
著者は GABA 合成遺伝子へ導入した変異による形質が優性であるかについて実証試験した。ゲノム編集
第３世代で GABA 蓄積が安定していた‘Micro-Tom’系統（1 塩基挿入型、53 塩基欠損型）と食用大型品
種‘愛知ファースト’（野生型）と交雑し F1系統を作出し、評価した（F1-野生型、F1-1塩基挿入型、F1-53
塩基欠損）。dCAPS 解析法とシーケンス法により、作出した全ての F1系統において変異がヘテロで導入さ
れていることが示された。次に、GABA合成遺伝子の発現を調査した。その結果、GABA合成遺伝子の発現
は緑熟期で最も高く、催色期、成熟期と徐々に低下することが観察された。全ての系統で同じ傾向が観察さ
れたが、緑熟期において、F1-1塩基挿入型の GABA合成遺伝子の発現が F1-野生型よりも有意に低いことが
示された。続いて、GABA 合成酵素の活性を調査した。その結果、変異導入型の GABA 合成酵素活性は、
野生型よりも 2 倍程度有意に上昇していたことが示された。さらに、緑熟期、催色期、赤熟期それぞれの
GABA含量を計測した。その結果、緑熟期においては、F1-野生型よりも 2.1倍から 2.3倍の上昇が、催色期
では、2.1倍から 2.5倍の上昇が、赤熟期では、3.0倍から 3.6倍の上昇が認められた。最後に、果実の縦径、
横径、新鮮重、着色、遊離アミノ酸含量、ベータカロテン含量、リコペン含量、総可溶性固形物含量および
滴定酸度を測定した。その結果、総可溶性固形物含量については、変異挿入型は野生型よりもわずかに低く、
滴定酸度については、F1-53 塩基欠損型は F1-1 塩基挿入型と F1-野生型よりも高いことが示された。総可溶
性固形物含量および滴定酸度以外については、変異導入型と野生型の間で差は示されなかった。以上の結果
から、GABA 高蓄積は優性形質であることが明らかとなった。また、GABA 合成遺伝子へ導入した変異は
GABA蓄積以外の形質への影響が極めて低いことが明らかになった。 
以上の著者による研究結果から、GABA 高蓄積の形質についてはゲノム編集技術を用いて作出した系統
が育種親として利用可能であることが明らかとなった。これまでのトマトの一代雑種育種では、親系統を作
出し F1の評価を行うまで概ね 3 年程度かかるとされていたが、ゲノム編集技術を用いれば、それが１年程
度まで短縮できると期待された。したがって、ゲノム編集技術の利用は、これまで得られなかった新たな変
異を育種親として短期間に提供できる可能性を示すと著者は結論した。 
 
 
               審   査   の   要   旨 
 
 著者は、ゲノム編集技術により内在遺伝子に変異を導入して作成した GABA高蓄積トマトの一代雑種親と
しての育種利用に関する研究に取り組んだ。その結果、導入した変異が 3世代に渡って安定して遺伝するこ
と、変異によって付与された GABA高蓄積形質が優性形質として発現すること、その他の形質に対する影響
も少ないことを示し、ゲノム編集技術が GABA高蓄積作物の分子育種技術として効果的であることを実験的
に検証した。ゲノム編集技術は、迅速育種技術となる可能性が高いことから、世界的に注目を集めている。
そのような状況の中、著者の研究はゲノム編集技術で開発された系統が育種親として有効なことを示した世
界的にも先駆的な研究であり、学術研究として意義のある研究であると判断された。また本論文の成果は、
ヒトの健康改善に寄与できる機能性成分として社会的注目度が向上している GABA を高蓄積する育種親が
ゲノム編集技術で迅速に開発できることを実証したことから、技術開発研究としても高く評価できる研究で
あると判断された。 
平成30年2月8日、学位論文審査委員会において、審査委員全員出席のもとに論文の審査及び学力の確認を
行い、本論文について著者に説明を求め、関連事項について質疑応答を行った。その結果、審査委員全員によ
って合格と判定された。 
 よって、著者は博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものとして認める。 
 


CRISPR/Cas9により得られたGABA高蓄積トマトの育種利用に関する研究

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CRISPR/Cas9により得られたGABA高蓄積トマトの育種利用に関する研究

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