Mügge, Felicitas

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Kardiale Fibroblasten und ihre durch kardiale Schädigung hervorgerufene Aktivierung spielen eine Schlüsselrolle im Prozess des kardialen Umbaus und der Entwicklung kardialer Fibrose. 
Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Rolle der Acetylierung von α-Tubulin in kardialen Fibroblasten mit besonderem Augenmerk auf die Bildung und Regulation von Primärzilien. Die Primärzilie ist eine aus Mikrotubuli bestehende, unbewegliche sensorische Struktur, die acetyliertes α-Tubulin enthält.
Zunächst wurde mittels Immunfluoreszenz gezeigt, dass 2D-Kulturen kardialer Fibroblasten von neonatalen Ratten (NRCF), neonatalen und adulten Mäusen (NMCF, AMCF) ebenso wie 2D-Kulturen humaner ventrikulärer kardialer Fibroblasten (HVCF) Primärzilien enthalten.
Zusätzlich wurden zwei 3D-Modelle genutzt, um Primärzilien zu untersuchen: Engineered Connective Tissue, in dem die kardialen Fibroblasten in Kollagen I eingebettet sind, sowie Engineered Heart Muscle, welcher aus allen kardialen Zellen besteht, die ebenfalls in einer Matrix aus Kollagen I eingebettet sind. Primärzilien konnten mittels Immunfluoreszenz in Schnitten beider künstlicher Gewebe detektiert werden.
Im nächsten Schritt wurde die Regulation der Primärzilien in kardialen Fibroblasten unter Einsatz zweier Substanzen betrachtet, die nachweislich die Acetylierung von α-Tubulin erhöhen: Tubastatin A (TubA) und Lithiumchlorid (LiCl). Tubastatin A ist ein spezifischer Inhibitor von HDAC6, der wichtigsten Deacetylase von α-Tubulin. Bei Lithiumchlorid handelt es sich um eine Substanz, die die α-Tubulin-Acetylierung durch einen bisher noch unvollständig verstandenen Mechanismus erhöht, welcher wahrscheinlich die Mobilisation der α-Tubulin-N-Acetyltransferase (ATAT1) involviert, die den Transfer von Acetylgruppen auf α-Tubulin katalysiert. Beide Behandlungen (TubA, LiCl) erhöhten die α-Tubulin-Acetylierung sowohl in NRCF, NMCF als auch in  AMCF, wie mittels Immunoblot-Analyse gezeigt werden konnte. 
Des Weiteren wurde festgestellt, dass die Behandlung mit Lithiumchlorid die Länge der Primärzilien erhöht. Obwohl der genaue Mechanismus, der zu dieser Verlängerung der Primärzilien führt, noch nicht geklärt ist, kann es als wahrscheinlich angesehen werden, dass der Effekt durch die Inhibition der Glykogen-Synthase-Kinase 3β vermittelt wird. 
Während pathologischer Prozesse, wie beispielsweise einem Myokardinfarkt, ist das Herz einem Sauerstoffmangel ausgesetzt. Hypoxische Bedingungen wurden erfolgreich in kardialen Fibroblasten neonataler Ratten induziert, wie die Stabilisierung des hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) zeigt. Unter den hypoxischen Bedingungen wurden die Zellen wiederum mit Tubastatin A und Lithiumchlorid behandelt, und es konnte festgestellt werden, dass Hypoxie sowohl unter Kontrollbedingungen als auch unter Lithiumchlorid-Behandlung zu einer Verlängerung der Primärzilien führt. 
Schließlich wurden die Auswirkungen beider Behandlungen auf die Zellproliferation von NRCF und AMCF untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass die Proliferationsfähigkeit von Zellen mit einer erhöhten Acetylierung von α-Tubulin-Acetylierung eingeschränkt war.Cardiac fibroblasts and their activation upon cardiac damage play a key role in pathological cardiac remodelling and the development of cardiac fibrosis. This thesis investigates the role of α-tubulin acetylation in cardiac fibroblasts with a special focus on formation and regulation of primary cilia. The primary cilium is a microtubule-based, immotile sensory structure, that contains acetylated α-tubulin.
First, the presence of primary cilia in cardiac fibroblasts in 2D culture of neonatal rat cardiac fibroblasts (NRCF), neonatal and adult mouse cardiac fibroblasts (NMCF, AMCF) and human ventricular cardiac fibroblasts (HVCF) was shown by immunofluorescence. This leads to the conclusion that cardiac fibroblasts from different species and maturation states possess primary cilia. 
Two 3D models were used to assess primary cilia: engineered connective tissue, in which cardiac fibroblasts are embedded in collagen I, as well as engineered heart muscle, which are composed of all cardiac cells surrounded by a collagen I matrix. Primary cilia were found in cardiac fibroblasts in immunostainings of sections of ECT and EHM.
In a next step the regulation of primary cilia in cardiac fibroblasts was examined by the use of two substances, which had been shown to increase the acetylation of α-tubulin; tubastatin A (TubA) and lithium chloride (LiCl). Tubastatin A is a specific inhibitor of HDAC6, the main deacetylase of α-tubulin. Lithium chloride leads to elevated levels of α-tubulin-acetylation by a mechanism that is not fully elucidated, but which probably involves the mobilisation of the α-tubulin-N-acetyltransferase (ATAT1), which catalyses the transfer of acetyl groups on α-tubulin. In immunoblot analysis the increased α-tubulin-acetylation following both treatments (TubA, LiCl) could be shown in NRCF, NMCF and AMCF.
It was found, that treatment with lithium chloride significantly increases the length of primary cilia. The exact mechanism by which lithium chloride leads to an elongation of primary cilia is not clear but it is likely that this effect is mediated via inhibition of the glycogen synthase kinase 3 β (GSK-3β).
One condition to which cells in the heart are exposed to during pathological processes such as myocardial infarction, is hypoxia. Hypoxic conditions were successfully induced in neonatal rat cardiac fibroblasts, as shown by the stabilisation of hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α). Under hypoxic conditions the cells were treated with tubastatin A and lithium chloride and it was found that hypoxia increases primary cilia length under control conditions, as well as in the presence of lithium chloride.
Finally, the impact of both treatments on proliferation of NRCF and AMCF was investigated and it could be shown, that the proliferation capacity of cells with an increased α-tubulin acetylation was impaired.2018-10-0

Georg-August-University Göttingen

The role of tubulin acetylation in cardiac fibroblasts

https://ediss.uni-goettingen.de/bitstream/handle/11858/00-1735-0000-002E-E4AE-E/Dissertation%20Felicitas%20M%c3%bcgge%20ediss-Format.pdf?sequence=1

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