Csikós, Ádám

Czeglédi, Levente

Gulyás, Gabriella

Jávor, András

Koncsos, Gábor

Oláh, János

Soltész, Beáta

Vass, Nóra

Acta Agraria Debreceniensis

Hungarian

University of Debrecen Electronic Archive

AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/49.
279
Szarvasmarha és bivaly tej és tej -
termé ké nek elkülönítése DNS-alapú
technika alkalmazásával
Soltész Beáta – Gulyás Gabriella – Csikós Ádám –
Koncsos Gábor – Vass Nóra – Oláh János –
Jávor András – Czeglédi Levente
Debreceni Egyetem Agrár- és Gazdálkodástudományok Centruma,
Mezgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar,
Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi  Intézet,
Debrecen
czegledi@agr.unideb.hu
ÖSSZEFOGLALÁS
Munkánk során célunk egy olyan DNS metodikán alapuló el já -
rás optimalizálása volt, amely megbízhatóan, alacsony költséggel
ké pes kimutatni tejbl, illetve tejtermékbl (sajt) az adott állatfaj je-
len létét, illetve arányát. Vizsgálatainkhoz tejkeverékekbl származó
mi tokondriális DNS-t használtunk fel, ahol a bivalytejhez különböz
arányokban (v/v%) – 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 5%, 10%, 15% –
ad tunk tehéntejet. Tejtermékként olyan sajtokat vontuk be a vizsgá -
lat ba, melyeket bivaly, illetve bivaly és tehéntej különböz arányú
ke verékébl (v/v%) állítottunk el (0%, 2%, 5%, 10%, 15% – tehén-
tej jelenléte).
A tejkeverékek esetében a PCR reakcióban a fajspecifikus pri -
mer párok felhasználásával 0,5 v/v%-os kimutatási határértéket álla -
pí tottunk meg, a 99,9/0,1 bivaly/tehén v/v%-os tej szarvasmarhára
nem adott detektálható jelet. Sajtokból is sikeresen azonosítottuk a
szar vasmarha és a bivaly DNS-ét. Mind a tej, mind a sajt esetén a
PCR fragment intenzitásának változása jelezte a tehéntej rész ará -
nyá nak növekedését.
Kulcsszavak: szarvasmarha, bivaly, tej, sajt, duplex PCR
SUMMARY
Aim of our study was the optimization of a DNA method, that is
appropriate for reliable, low cost identification of animal species in
milk and dairy product (cheese) and to determine the ratio of species.
Mitochondrial DNA was used in our work to analyse buffalo/cow
milk mixtures contained different ratio of bovine milk such as 0.1%,
0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 5%, 10%, 15% (v/v%). Buffalo cheese were
produced using buffalo and cows milk (0%, 2%, 5%, 10%, 15% –
v/v% cows milk in buffalo milk).
In case of milk mixtures, using species specific primers, the PCR
assay showed a 0.5 v/v% detection limit. Cattle, in the buffalo/cows
milk 99.9/0.1 v/v% mixture, was not detectable. The identification of
buffalo and cows DNA in cheese was successful. The intensity of
eletroforetic PCR fragment indicated the increase of cow milk ratio
in milk and cheese samples as well
Keywords: cattle, buffalo, milk, cheese, duplex PCR
BEVEZETÉS
A tisztességtelen kereskedelmi gyakorlat, nevezete-
sen a tehéntej felhasználásával történ termék ha mi sí -
tás, valamint a fogyasztók félretájékoztatása, meg köve-
teli az élelmiszerek hatékony és rutinszeren végezhet
ellenrzését. Az élelmiszerek összetevinek és azok
szár mazásának ellenrzésére az elmúlt évtizedekben
szá mos molekuláris biológiai technikát dolgoztak ki.
A fehérjék (Rolland, 1995; Addeo et al.,1990) és a
DNS kimutatására és mennyiségük mérésére alkalma-
zott, jól bevált technikákon kívül a fajokra jellemz
zsír savprofilra is dolgoztak ki metodikákat (Lumley,
1996), de ezek közel sem voltak olyan hatékonyak,
mint a DNS vagy fehérjekomponensek vizsgálatára
hasz nált módszerek. A DNS-alapú technikák közül ki -
ma gasló hatékonyságú a PCR eljárás (Higgins et al.,
1992), illetve annak módosított változatai, mint például
a PCR-RFLP (Kocher et al., 1989), PCR-SSCP (Plath
et al., 1997) vagy a multiplex-PCR reakciók (Bottero et
al., 2003). Ezekkel az eljárásokkal kis mennyiség te -
héntej jelenlétét is ki lehet mutatni a tejtermékekbl. 
Az irodalmi adatok alapján feltételezzük, hogy köl t-
séghatékonyabb és a szarvasmarha tejjel történ szeny -
nye zések kimutatására érzékenyebb eljárások dol goz-
 hatók ki a tej és tejtermékek eredetigazolásának vonat -
ko zá sában. Célunk olyan DNS metodikán alapuló el já -
rás optimalizálása, amely megbízhatóan alacsony költ -
séggel képes kimutatni tejbl, illetve tejtermékbl (sajt)
az adott állatfaj jelenlétét, illetve arányát. Mun kánk
során bivaly és szarvasmarha fajokból származó tej és
sajt mintákból, illetve azok keverékébl fajazo no sítást
vé geztünk. 
ANYAG ÉS MÓDSZER
Tejminták begyjtése, tárolása 
4–4 bivaly és szarvasmarha tehéntl gyjtöttünk elegy -
tej mintákat 50 ml-es Falcon csövekbe, melyeket fel-
használásig -80 °C-on tároltunk.
Sajtminták elállítása, tárolása 
Bivaly és szarvasmarha tejbl különböz keverési
ará nyú sajtokat állítottunk el. A sajtkeverékekben a
te héntej aránya 0, 2, 5, 10, 15 v/v% volt. A sajtokat -20 °C-
on tároltuk. 
DNS kivonás tejbl
A tejmintákból a DNS-t az Orbán és Zsolnai (1999)
által leírt módszer alapján végeztük, melyet zsír sze pa -
rá lással egészítettünk ki. 1 ml tejet 7 percig centri fu -
gál tunk 13 000 g-n. A felülúszó tetején összegylt tej -
zsírt eltávolítottuk, majd a felülúszót a pellettel együtt
felszuszpendáltuk. 500 l mosó oldatot [10 mM Tris
(pH 7,5); 0,2 mM EDTA (pH 7,43)] mértünk ki 1,5 ml-
es eppendorf csövekbe, majd 50 l tejmintát mos tunk
bele az oldatba. Ezután 2 percen át centri fu gál tuk a
csö veket 12 000 g-n, majd leöntöttük a felül úszót. A
mo sási lépést háromszor ismételtük. Ezt követen a
Soltész B. et al.:Layout 1  11/13/12  12:39 PM  Page 1
csö vek alján lév pelletet felszuszpendáltuk 100 l
lízis puffert (10 mM Tris; 50 mM KCl; 0,5 v/v% Tween
20) és 80 g Proteináz K enzimet (Sigma) tartalmazó
elegyben. Az emésztés 56 °C-os vízfürdben 60 percig
tör tént, majd az enzim inaktiválása céljából a min tá kat
10 percig 94 °C-os vízfürdbe helyeztük. A tisz títást kö -
ve ten az extraktumokban lév DNS koncent rá ci óját
spektrofotométer segítségével mértük. Az el ké szí tett
min tákat -20 °C-on tároltuk a további vizs gála tig.
DNS kivonás sajtból
A sajtmintákból történ DNS kivonás De et al.
(2011) által leírt fenol-kloroformos módszer alapján
tör tént. A sajtmintákat folyékony nitrogénnel homoge-
ni záltuk, ezekbl 70 mg-ot kimértünk, majd 900 l ex-
trakciós puffer (75 mM NaCl; 2 mM EDTA; 10 mM
Tris-HCl; 0,45 v/v% SDS) és 120 g Proteináz-K
enzim (Sigma) elegyével inkubáltuk egy éjszakán át
50 °C-on. Ezt követen 900 l fenolt [Sigma, (pH=8)]
adtunk a mintákhoz és 15 700 g-n 10 percig centri fu -
gál tuk, majd a fels vizes fázisból 800 l-t átvittünk
egy másik csbe. 800 l 25:24:1 arányban összeállított
fenol-kloroform-izoamil-alkohol (Sigma) elegyet ad-
tunk a mintákhoz, ismét centrifugáltuk 15 700 g-n 10
per cen át, majd a fels vizes fázisból 500 l-t másik
cs be vittünk át. 500 l 24:1 arányú kloroform-izo -
amil-alkoholt (Sigma) mértünk a mintákra, majd újra
cent rifugáltuk 15 700 g fordulaton, ezután 300 l meny-
nyi séget vittünk át a felülúszóból 1,5 ml-es eppendorf
csbe. A DNS kicsapása 0,8 térfogat arányú izopro pa -
nol lal történt, a csöveket 5 percre 4 °C-ra helyeztük,
majd centrifugáltuk 12 500 g-n 10 percig, ekkor a nuk-
le in sav a cs alján pelletként volt megfigyelhet. A pel-
let mosása 70 v/v%-os etanollal (VWR) történt, majd
pa pírtörlre fordítva szárítottuk a mintákat. Végül 100 l
TE pufferben (10 mM Tris-HCl (pH 8); 1 mM EDTA)
eluáltuk a pelletet 65 °C-ra beállított vízfürdben egy
órán át. Az inkubálást követen -20 °C-ra helyeztük a
min tákat a következ felhasználásig.
Duplex PCR reakció és agaróz gélelektroforézis
Fajonként eltér SNP-k alakulhatnak ki a DNS
szek venciákban, amelyek megfelel markerként szol-
gál nak a fajok, illetve fajták elkülönítésére. Az elzetes
vizs gálatok során, az adatbázisokban szerepl szakiro-
dal mi adatok alapján választottuk ki a két faj együttes
ki mutatásához szükséges primereket, és használtuk fel
a PCR vizsgálatokhoz. Mindkét faj esetén mitokond ri -
á lis DNS-t használtunk, a szarvasmarha esetén a 12S
rRNS gén, a bivaly kimutatásánál a D loop régió faj -
spe cifikus szakaszát amplifikáltuk. A felhasznált pri -
me rek szekvenciája szarvasmarhánál:
– F: 5’ GT A C TACTAGCAACAGCTTA 3’ és
– R: 5’ GCTTGATTCTCTTGGTGTAGAG 3’
(Bottero et al., 2003);
bivalynál:
– F: 5’ ACTAGATCACGAGCTTGATCACCATGC 3’ és
– R: 5’ GTTATGTGTGAGCATGGGCTGATTGGA 3’
(De et al., 2011) volt.
A duplex-PCR reakciókhoz alkalmazott reakcióel-
egy összetétele 20 l reakcióközegben: 4 mM MgCl2
(Fermentas), 1DreamTaq-puffer (Fermentas), 200 M
dNTP (Fermentas), 2 pmol Reverse primer (szarvas-
mar ha), 2 pmol Forward primer (szarvasmarha), 3,6 pmol
Reverse primer (bivaly), 3,6 pmol Forward primer (bi-
valy) 1U DreamTaq-polimeráz (Fermentas). A PCR
Mixhez 100 ng DNS-t adtunk. A felhasznált primerek
mennyiségének egymáshoz viszonyított arányát opti-
ma lizálási elkísérletekben állapítottuk meg, melyek
ered ményeit az Eredmények részben ismertetjük. A
pri merpárok tapadási hmérsékletét hmérséklet-gra-
di ens PCR-ben határoztuk meg, így megállapítottuk,
hogy a kiválasztott primerpárok olvadási hmérséklete
60 °C. A felszaporított PCR termék mérete a szarvas-
mar ha specifikus primerpár esetén 256 bp, a bivaly
spe cifikus primerpárnál 226 bp. Az amplikonokat
GelRed-del (Biotium, USA) festett 2 m/v%-os agaróz
gé len, elektroforézissel (4 V/cm-en, 1TAE puffer)
vizs gáltuk.
EREDMÉNYEK
Tejkeverékek vizsgálati eredményei
A szarvasmarha és a bivaly primerek arányának op-
ti malizálása során a DNS sávintenzitások egy sé ge sí té -
se volt a cél. Azért tartottuk meghatározó lépésnek az
egy ségesítést, hogy a késbbi munka során a különbö -
z v/v%-ban kevert tejekbl tisztított DNS-sel el vég -
zett PCR-reakciók eredményei jelezzék az adott faj
rész arányát. Ennek megfelelen az azonos mennyiség
(ng) genomiális DNS alapján történ optimalizálás so -
rán a különböz primerarány beállításokat korábbi dup lex
PCR vizsgálatok alapján terveztük meg, a szarvasmar ha/
bivaly primerpár arányt a bivaly-specifikus primerpá -
rok arányát növelve állítottuk be.
A LabWorks™ program által elvégzett sávintenzi -
tá sok kvantifikálása alapján a 9. minta két sávjának
ará nya 51,4/48,6 (szarvasmarha/bivaly), a 10. minta
két sávja esetében az arány 50,647/49,353 (szarvas-
mar ha/bivaly). A mért értékeket alapul véve a szarvas-
marha-bivaly együttes kimutatásához 1:1,8 (szarvas-
marha/bivaly) primerpár arányt alkalmaztunk (1. áb ra).
1. ábra: A bivaly- és szarvasmarha-specifikus primerpárok
arányának optimalizálása
Megjegyzés: az ábrán feltüntetett arányok a szarvasmarha:bivaly
primerarányok
Figure 1: Optimalisation of ratio of cattle and buffalo specific
primers
Cattle(1), Buffalo(2), Note: the ratios in the figure are the primary
proportions of cattle/buffalo
A vizsgálatok során tejkeverékekbl származó ge -
no miális DNS-t használtunk fel, ahol a bivalytejet kü -
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/49.
280
   
Soltész B. et al.:Layout 1  11/13/12  12:39 PM  Page 2
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/49.
lön böz arányokban (v/v%) – 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%,
2%, 5%, 10%, 15% – kevertünk tehéntejjel. Megálla -
pít ható, hogy a bivaly/szarvasmarha tejkeverékben 0,5
v/v% volt a kimutathatósági küszöb (2. és 3. ábra).
2. ábra: A bivaly/szarvasmarha tejkeverékbl származó
DNS gélmintázata
Megjegyzés: az ábrán feltüntetett v/v% értékek a szarvasmarhatej
jelenlétét jelzik a tejkeverékben
Figure 2: DNA gelpattern of buffalo/cattle milk mixture
Cattle(1), Buffalo(2), Note: the v/v% values in the figure represent
the presence of cow’s milk in the milk mixture
3. ábra: A bivaly/szarvasmarha tejkeverékbl származó
DNS gélmintázata
Megjegyzés: az ábrán feltüntetett v/v% értékek a szarvasmarhatej
jelenlétét jelzik a tejkeverékben
Figure 3: DNA gelpattern of buffalo/cattle milk mixture
Cattle(1), Buffalo(2), Note: the v/v% values in the figure represent
the presence of cow’s milk in the milk mixture
Sajtminták vizsgálati eredményei
A sajtminták vizsgálata során szintén az optimali -
zált primerpár arányokat használtuk. A vizsgálatokhoz
sajt mintákból származó DNS-t amplifikáltunk, ahol a
sajt készítés során a bivalytejhez különböz arányok-
ban (v/v%) – 2%, 5%, 10%, 15% – adtunk tehéntejet.
Megállapítható, hogy a bivaly/szarvasmarha tej ke -
ve rékben a kimutathatósági küszöb 2 v/v% volt, va la -
mint, hogy a 100 v/v%-ban bivalytejbl készített sajt a
vá rakozással ellentétben szarvasmarha DNS-t is tartal-
ma zott (4. ábra). Ennek oka lehet, hogy a sajtkészítés
so rán az edények, eszközök elmosása nem volt tö ké -
le tes, így tudatos „szennyezés” nem történt, mégis ki -
mu tatható a szarvasmarhatej jelenléte. Ez felhívja a
fi gyelmet arra, hogy kis arányú jelenlét a gélen vár ha -
tó an nem helytelen piaci gyakorlatot jelent. 
4. ábra: A bivaly/szarvasmarha tejkeverékbl készült sajtból
származó DNS elektroforézisének gélképe
Megjegyzés: az ábrán feltüntetett v/v% értékek a szarvasmarhatej
jelenlétét jelzik a sajtkeverékben
Figure 4: DNA gelpattern of cheese from buffalo/cattle milk mixture
Cattle(1), Buffalo(2), Note: the v/v% values in the figure represent
the presence of cow’s milk in the cheese mixture
KÖVETKEZTETÉSEK
A kimutatáshoz felhasznált tejkeverékek a tehénte-
jet 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 10; 15 v/v% arányban tartal-
maz ták, a sajtkeverékekben a tehéntej aránya 0; 2; 5;
10; 15 v/v% volt. A tejkeverékek esetében a PCR reak-
ci óban a fajspecifikus primerpárok felhasználásával si -
ke rült elérni a 0,5 v/v%-os kimutatási határértéket,
azon ban a 0,1 v/v%-os tehéntej koncentráció kimuta -
tá sa sikertelennek bizonyult. Így is elmondható azon-
ban, hogy a módszer érzékeny a fajspecifikus szek ven-
ciák kimutatása terén. A sajtkeverékek vizsgálata során
mind a négy keverési arány esetében sikerült duplex-PCR
reakcióban kimutatni és elkülöníteni a két fajt. 
Kemény sajtok esetében, a ß -kazein gén specifikus
sza kaszainak felszaporításával a tehéntej 0,5 v/v%-os
je lenlétét kimutatták. Ez az eredmény jelzi a módszer
ér zékenységét, ugyanis a sajtok érési folyamata során
je lentsen degradálódhat a szomatikus sejtekbl szár-
ma zó DNS, rontva a kimutatás lehetségét (Plath et al.,
1997). Tehéntejjel kevert kecsketej vizsgálata során
olyan keverékeket készítettek, amelyek 1 v/v%-ban, 0,5
v/v%-ban és 0,1 v/v%-ban tartalmaztak tehéntejet a
kecs ketej mellett. Ebben a vizsgálatban a tehéntej 0,5
v/v%-os arányát még lehetett detektálni, de a 0,1 v/v%-
os arányt már nem, azonban a PCR-rel történ kimuta -
tás ebben az esetben is érzékenynek mutatkozott
(Bottero et al., 2003). Több tanulmány során is a 0,5
v/v%-os arány bizonyult a vizsgálat kimutatási határ ér -
té kének (Mayer, 2005; Rodríguez et al., 2005).
Ugyanakkor az eredmények értelmezéséhez ér de -
mes megjegyezni, hogy a termékhamisítások során
nem az alacsony részarányban megjelen idegen faj ki -
mu tatása az elsdleges cél, hiszen egy ilyen kismérték
„szennyezés” a gyártó számára nem jár gazdasági elny-
nyel, ezért jellemzen az nem utal tudatos termék ha -
mi sításra sem.
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
A publikáció elkészítését a TÁMOP-4.2.1/B-
09/1/KONV-2010-0007 és a TÁMOP-4.2.2/B-10/1-
2010-0024 számú projektek támogatták. A projekt az
Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap
társfinanszírozásával valósult meg.
281
     
   
     
    
     
Soltész B. et al.:Layout 1  11/13/12  12:39 PM  Page 3
Addeo, F.–Moio, L.–Chianese, L.–Stingo, C.–Di Luccia, A. (1990):
Improved procedure for detecting bovine and ovine milk mixtures
in cheese by isoelectric focusing of para--casein. Milchwissen -
schaft. 45: 221–224.
Bottero, M. T.–Civera, T.–Nucera, D.–Rosati, S.–Sacchi, P.–Turi, R. M.
(2003): A multiplex polymerase chain reaction for the identification
of cows’, goats’ and sheeps’ milk in dairy products. International
Dairy Journal. 13: 277–282.
De, S.–Brahma, B.–Polley, S.–Mukherjee, A.–Banerjee, D.–Gohaina
M.–Singh, K. P.–Singh, R.–Datta, T. K.–Goswami, S. L. (2011):
Simplex and duplex PCR assays for species specific indentification
of cattle and buffalo milk and cheese. Food Control. 22: 690–
696.
Higgins, D. G.–Bleasby, A. J.–Fuchs, R. (1992): CLUSTAL W:
Improved software for multiple sequence alignment. Computer
Applications in the Biosciences. 8: 4420–4449.
Kocher, T. D.–Thomas, W. K.–Mayer, A.–Edwards, S. V.–Pääbo, S.–
Villablanca, F. X.–Wilson, A. C. (1989): Dynamics of mitochondrial
DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with
conserved primers. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA. 86: 6196–6200.
Lumley, I. D. (1996): Authenticity of meat and meat products. [In:
Ashurst, P. R.–Dennis, M. J. (eds.) Food authentication.] Blackie
Academic and Professional. 108–139. 
Mayer, H. K. (2005): Milk species identification in cheese varieties
using electrophoretic, chromatographic and PCR techniques.
International Dairy Journal. 15: 595–604.
Plath, A.–Krause, I.–Einspanier, R. (1997): Species identification in
dairy products by three different DNA-based techniques.
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung. 205:
437–441.
Rodríguez, M. A.–García, T.–González, I.–Hernández, P. E.–Martín, R.
(2005): TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation
of pork in meat mixtures. Meat Science. 70: 113–120.
Rolland, M. P.–Bitri, L.–Besancon, P. (1995): Monospecificity of the
antibodies to bovine s1-casein fragment 140–149: application
to the detection of bovine milk in caprine dairy products. Jour-
nal of Dairy Research. 62: 83–88.
Zsolnai, A.–Orbán, L. (1999): Accelerated separation of random
complex DNA patterns in gels: comparing the performance of
discontinuous and continuous buffers. Electrophoresis. 7: 1462–
1468.
282
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/49.
IRODALOM
Soltész B. et al.:Layout 1  11/13/12  12:39 PM  Page 4


Szarvasmarha és bivaly tej és tejtermékének elkülönítése DNS-alapú technika alkalmazásával

https://dea.lib.unideb.hu/dea/bitstream/handle/2437/160640/file_up_Solte%3fsz%20B.%20et%20al..pdf?sequence=1&isAllowed=y

Szarvasmarha és bivaly tej és tejtermékének elkülönítése DNS-alapú technika alkalmazásával

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

University of Debrecen Electronic Archive