Czeglédi, Levente

Gulyás, Gabriella

Jávor, András

Prokisch, József

Acta Agraria Debreceniensis

University of Debrecen Electronic Archive

AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/50. 
 
 
 
Csirkemáj proteomjának változása szelén indukció hatására – 2D PAGE optimalizálás 
 
Gulyás Gabriella – Czeglédi Levente – Prokisch József – Jávor András 
Debreceni Egyetem Agrár- és Gazdálkodástudományok Centruma, 
Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar 
Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Debrecen 
gulyas@agr.unideb.hu 
 
 
ÖSSZEFOGLALÁS 
 
Jelen tanulmányban célul tűztük ki, egy olyan kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE) metodika kidolgozását, mely 
segítségével a legtöbb egyedi fehérjét tudjuk azonosítani a házityúk máj proteomjában, valamint arra is kerestük a választ, hogy milyen 
változások történnek a csirkemáj fehérje expressziójában szelén indukció hatására. A proteomikai vizsgálatba 12 broiler csirkét vontunk be. A 
kontroll csoportban (6 egyed) a takarmányban lévő szelén koncentrációja 0,2 mg/kg, a kísérleti csoportnál (6 egyed) a takarmány Se-
koncentrációja 4,25 mg/kg volt. Számos tesztelő futtatást követően optimalizáltunk egy olyan 2D PAGE metodikát, mely alkalmas nagyszámú 
egyedi fehérje elkülönítésére. A szelén kiegészítésben részesült állatok májmintáiban átlagosan 747 fehérjepontot tudtunk egymástól 
elkülöníteni a géleken, a kontroll csoportban 741-et. Hat olyan fehérjét találtunk, melyek csak a kísérleti csoport egyedeinél expresszálódtak. A 
továbbiakban tömegspektrometriával azonosítjuk ezeket a fehérjéket és összefüggéseket keresünk a szelén élettani hatásai és e fehérjék 
expressziója között. 
 
Kulcsszavak: csirkemáj, proteomika, szelén, 2D-PAGE 
 
SUMMARY 
 
The aims of the present study were to optimize a two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis method to chicken liver proteome 
and to determine the changes of protein expression caused by selenium. Twelve broiler chicken were used in this experiment. The selenium 
intake was 0,2 mg/kg in the control group (6 chicken) and 4,25 mg/kg in the experimental group (6 chicken). Using the optimized proteomic 
approach, we have succesfully separated 747 proteins in the experimental group and 741 proteins in the control group. We found six proteins, 
wich expressed only in the samples of experimental group. Further investigations need to determine these six proteins with mass spectrometry 
(MS) and look for the correlation between the physiological effects of selenium and the expression of these proteins. 
 
Keywords: chicken liver, proteomics, selenium, 2D-PAGE 
 
 
BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 
 
A szelén esszenciális szerepet játszik a biológiai folyamatokban. Elsődleges feladata a szabadgyökök 
semlegesítése, tehát az antioxidáns funkció, emellett részt vesz a szervezet védekezőképességének növelésében, a 
sejthártya stabilizálásában (Navarro-Alarcon és Cabrera-Vique, 2008). Az antioxidáns enzimek közül több is 
szelén-dependens, például a glutation peroxidáz (5 féle izoformája létezik), mely védi a sejteket és a membránokat 
az oxidatív stressztől, a hidroperoxidáz redukálásával (Watanabe et al., 1997). Az ún. szelenoproteinek 
specifikusan szelént építenek be, ezek metabolikus funkciója még nem tisztázott (Wang és Xu, 2007). 
Élettani hatása ambivalens, ugyanis hiányában betegségek alakulnak ki, túladagolása azonban mérgezéshez 
vezet (Gergely, 2006). Takarmányozási kísérletek során megállapították, mennyi az ajánlott és a maximum szelén 
koncentráció a takarmányban csirkék esetén. Az ajánlott érték 0,15 mg Se/kg (NRC, 1994), maximum érték 0,3 
mg Se/kg az USA-ban (Payne et al., 2005), míg az Európai Unióban 0,5 mg Se/kg (Zoidis et al., 2010). 
Embereknél 40µg/nap a minimum érték, 55µg/nap az ajánlott és a 400µg/nap a még tolerálható maximum érték. 
Napi 300µg szelén bevitel mellett érik el a szelén-dependens enzimek a maximum expressziós szintjüket és ez az a 
mennyiség mely csökkenti a rák kialakulásának kockázatát (Thomson, 2004). Magyarországon különösen fontos 
lenne az élelmiszerek szelénszintjének emelése, hiszen talajaink és ezért élelmiszereink is szelénhiányosak. Egy 
szelénben gazdag étrend 30–50%-kal csökkentheti a daganatos megbetegedések előfordulását (Clark et al., 1996). 
Mivel a szelén a szövetekben fehérjékkel lép kapcsolatba (Burk és Hill, 1993), ezért a proteomikai vizsgálatok 
megfelelőek arra, hogy nyomon követhessük a szelén hatására bekövetkező expressziós változásokat. A 
proteomikai kutatások az állattenyésztési tudományok területén igen kis részarányt képviselnek, ellentétben a 
humán kutatásokkal (Lippolis és Reinhardt, 2008). A gél alapú proteomikai vizsgálat nagyon érzékeny metodika, 
számos faktort változtathatunk a mintatisztítás, az első dimenzió és a második dimenzió során is, melyek mind 
befolyásolják az elválasztás eredményességét. 
Jelen tanulmányban célul tűztük ki, egy olyan két-dimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE) 
metodika kidolgozását, mely segítségével a legtöbb egyedi fehérjét tudjuk azonosítani a házityúk máj 
proteomjában, valamint hogy megállapítsuk, milyen változások történnek a csirkemáj fehérje összetételében szelén 
indukció hatására. 
 
9 
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/50. 
 
 
 
ANYAG ÉS MÓDSZER 
 
Állatok és kezelés 
 
A kísérletet 12 Cobb 500 broiler csirkével állítottuk be. Két vizsgálati csoportot hoztunk létre, az egyik a 
kontroll (6 egyed), melynek takarmánykeverékében 0,2 mg/kg Se volt. A másik a kísérleti csoport (6 egyed), ahol 
a takarmány Se-koncentrációja 4,25 mg/kg volt. A takarmányozás 7 héten át tartott. A szelén kiegészítés 
LactoMicroSel adalék hozzáadásával történt, mely baktériumokban termeltetett elemi szelént tartalmaz. A kísérleti 
csoport takarmánykeverékében lévő szelén mennyisége, többszöröse az Európai Unióban megengedett maximum 
értéknek (0,5 mg/kg), erre azért volt szükség, hogy a szelén hatására a fehérjék expressziójában esetlegesen 
bekövetkező változások kimutathatóságának valószínűségét növeljük. 
 
Mintagyűjtés 
 
A mintagyűjtés 7 hét takarmányozást követően az állatok vágásakor történt. Közvetlenül az állat kivéreztetése 
után orvosi szikével 0,5 g máj mintát gyűjtöttünk 3 ismétlésben cryocsövekbe, melyeket azonnal folyékony 
nitrogénbe helyeztünk, a további tárolás -80 °C-on történt. Az egyedileg tárolt mintát több pontmintából alkottuk, 
a mintákat a szövet felszíne alatti 1 cm-es mélységből vettük. 
 
Mintatisztítás 
 
A -80 ºC-on tárolt mintából 500 mg-ot kimértünk, dörzsmozsárban folyékony nitrogénnel porrá törtük. A 
fehérjék oldatba vitelére két módszert teszteltünk: 
1. A homogenizált mintából 100 mg-ot kimértünk, hozzáadtunk 80µl-t a 25×-ös protease inhibitor cocktail-ból, 
majd 1ml lízis puffert (két különböző összetételű lízis puffert is teszteltünk: 1. 2M thiourea, 8M urea, 2% CHAPS, 
50mM DTT, 0,2% 100X Bio-Lyte 3/10 ampholyte, a pH 5–8-as stripeknél 4/6 és 6/8-as ampholyte-ot használtunk 
1:2 arányban mindkét lízis puffer esetében 2. 8,5M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 60mM DTT, 0,2% 100X Bio-
Lyte 3/10 ampholyte). Egy órát szobahőmérsékleten inkubáltuk, ezt követően 15 000 g-n 45 percig centrifugáltuk. 
Bradford reagens segítségével lemértük a koncentrációját. 
2. A homogenizált mintából 100 mg-ot kimértünk, hozzáadtunk 80µl-t a 25×-ös protease inhibitor cocktail-ból, 
majd 1ml lízis puffert (2M thiourea, 8M urea, 2% CHAPS, 50mM DTT, 0,2% 100X Bio-Lyte 3/10 ampholyte, a 
pH 5–8-as stripeknél 4/6 és 6/8-as ampholytot használtunk 1:2 arányban). Egy órát szobahőmérsékleten 
inkubáltuk, ezt követően 15 000 g-n 45 percig centrifugáltuk. A felülúszót ReadyPrep 2-D Cleanup Kit (BioRad) 
segítségével tisztítottuk tovább. A kit eltávolítja a mintákból a detergenseket, sókat, nukleinsavakat és lipideket, 
melyek zavarhatják az izoelektromos fókuszálást. A tisztított minták koncentrációját Bradford módszerrel mértük. 
A fehérje koncentrátumokat felhasználásig -80 °C-on tároltuk. 
 
Kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE) 
 
A mintákból 150, 200 ill. 300 µg-ot vittünk fel a 17cm-es pH 3–10-es és pH 5–8-as IPG stripekre. Két 
különböző rehidratáló oldatot teszteltünk: 
1. normál rehidratáló oldat: 2M thiourea, 8M urea, 2% CHAPS, 50mM DTT, 0,2% 100X Bio-Lyte 3/10 
ampholyte, 0,002% Bromphenol Blue, a pH 5–8-as stripeknél 4/6 és 6/8-as ampholytot használtunk 1:2 
arányban; 
2. deStreak rehidratáló oldat: 2M thiourea, 8M urea, 2% CHAPS, 15mg/ml DeStreak reagens, 0,2% 100X Bio-
Lyte 3/10 ampholyte, 0,002% Bromphenol Blue, a pH 5–8-as stripeknél 4/6 és 6/8-as ampholytot használtunk 
1:2 arányban. 
Az első dimenziónál kipróbáltuk az egy lépésben történő fókuszálást és a többlépéseset is. Egy lépésben: 
10 000 V–50 000 Vh Rapid Ramp. Több lépésben: 1. lépés -250 V 20min Linear Ramp  2. lépés -10 000 V 2,5 h 
Linear Ramp  3. lépés -10 000 V 40 000 V-h Rapid Ramp, 20 °C-on 50µA/strip, összesen kb. 50 000 Vh. A 
fókuszált stripeket az SDS-PAGE előtt equilibráltuk. 10 percig inkubáltuk az equilibráló I. oldatban (6M urea, 
2%SDS, 0,05M Tris/HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2%DTT), majd 10 percig az equilibráló II. oldatban (6M urea, 
2%SDS, 0,05M Tris/HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2,5% iodoacetamide). 
Második dimenzióban a gélek futtatása a BioRad Protean Plus Dodeca cell rendszerben történt, így egyszerre 
12 gélt tudtunk kezelni, ezzel próbáltuk elkerülni a nem egy időben történő futtatásokból eredő eltéréseket a gélen. 
A poliakrilamid gélek 12%-os koncentrációjúak voltak. A futtató puffer 1X Tris-Glycin-SDS oldat. 
A poliakrilamid géleken lévő fehérje foltok láthatóvá tételére kétféle eljárást használtunk, az egyik egy 
ezüstfestés (Shevchenko et al., 1996), a másik pedig egy fluoreszcens jelölés (Sypro Ruby). Mindkét festék 
érzékenysége 1ng. Az ezüstfestés lépései: 1. fixálás: 50% metanol, 5% ecetsav 2. mosás: 50%metanol 3. 
érzékenyítés: 1,27 mM sodium thiosulfate pentahydrate 5. festés: 0,15% ezüst nitrát 7. előhívás: 
0,04%formaldehid, 2% nátrium karbonát 8. leállítás: 5% ecetsav. A Sypro Ruby festés lépései: a géleket először 
egy prefixáló oldatba helyeztük, melynek összetétele: 50% metanol, 10% ecetsav. Ezt követte maga a festő oldat: 
10 
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/50. 
 
 
 
Sypro Ruby Protein Gel Stain (Lonza). Végül a postfixáló oldatba kerültek: 10% metanol, 7% ecetsav. A gélek 
elemzését a PDQuest (BioRad) software segítségével végeztük. 
 
EREDMÉNYEK 
 
Számos tesztelő futtatást követően optimalizáltunk egy olyan 2 D PAGE metodikát csirkemáj mintákra, mely 
alkalmas nagyszámú egyedi fehérje elkülönítésére. A megfelelő lízis puffer összetétele: 8,5M urea, 2M thiourea, 
4% CHAPS, 60mM DTT, 0,2% 100X Bio-Lyte 3/10 ampholyte. A tisztításnál a Cleanup Kitre nincs szükség, mert 
fehérjeveszteséget okoz. A pH 3–10-es IPG stripekre 150 µg fehérjét vittünk fel, ez az a mennyiség az, ahol a 
pontok nem folynak össze, de még jól láthatóak. Az 1. ábrán egy olyan gélképet mutatunk be, melynél a felvitt 
fehérje mennyisége 300 µg, a pH 5–10-es, 70–240 kDa-os tartományban, ahol a legtöbb fehérjét várnánk, nem 
tudunk megkülönböztetni egyedi pontokat, mert a nagy anyagmennyiség miatt összemosódnak.  
 
1. ábra: Túl nagy fehérjemennyiség a gélen 
 
 
    Mw: molekula tömeg, pI: izoelektromos pont 
 
Figure 1: High sample load 
Isoelectric point(1), Molecular weight(2) 
 
A DeStreak reagenst tartalmazó rehidratáló oldat csökkentette a gélek bázikus régiójában látható vízszintes 
csíkozottságot, ezért ezt az oldatot használtuk a gélek rehidratálására: 2M thiourea, 8M urea, 2% CHAPS, 
15mg/ml DeStreak reagens, 0,2% 100X Bio-Lyte 3/10 ampholyte, 0,002% Bromphenol Blue. Az izoelektromos 
fókuszálásnál a több lépéses módszernél jobb eredményeket értünk el, mint az egylépésesnél. A 2. ábra az 
egylépéses fókuszálás hibáját mutatja. Az egész gélen vízszintes csíkozottság látható, melyet valószínűleg a 
kezdeti nagy feszültség okoz. 
 
2. ábra: Egy lépéses izoelektromos fókuszálás 
 
 
     Mw: molekula tömeg, pI: izoelektromos pont 
 
Figure 2: One step isoelectric focusing 
Isoelectric point(1), Molecular weight(2) 
11 
M
w
(kD
a)(
2) 
M
w
(kD
a)(
2) 
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/50. 
 
 
 
 
A gélek festésére teszteléskor ezüst-nitrátot használtunk. Nagy mintaszám esetén azonban ez a festési mód nem 
a legmegfelelőbb, mivel az ismételhetősége nem tökéletes. Ezért nagyszámú gél egyidejű festésére Sypro Ruby 
Protein Stain (Lonza) festéket használtunk, melynek érzékenysége az ezüst-nitrát festékével megegyező (1ng). Az 
3. ábrán láthatjuk azt a gélképet, melyet e kondíciók használatával készítettünk. 
 
3. ábra: Csirkemáj proteomjának gélképe 
 
 
          Mw: molekula tömeg, pI: izoelektromos pont 
 
Figure 3: Chicken liver proteome 
Isoelectric point(1), Molecular weight(2) 
 
A szelén kiegészítésben részesült állatok májmintáiban átlagosan 747 fehérjepontot tudtunk egymástól 
elkülöníteni a géleken, a kontroll csoportban 741-et. Hat olyan fehérjét találtunk, melyek csak a kísérleti csoport 
egyedeinek gélképein detektálhatók (4. ábra), ebből három a semleges kémhatású régióban található, kettő az 
enyhén bázikus, egy pedig az erősen bázikus tartományban.  
 
4. ábra: A kontroll és a kísérleti csoport fehérje expressziójában mutatkozó különbségek 
 
 
         Mw: molekula tömeg, pI: izoelektromos pont 
 
Figure 4: The differences between liver proteome of control and experimental group 
Isoelectric point(1), Molecular weight(2) 
 
 
 
KÖVETKEZTETÉSEK 
 
A továbbiakban tömegspektrometriával azonosítjuk ezeket a fehérjéket és összefüggéseket keresünk a szelén 
élettani hatásai és e fehérjék expressziója között. Többféle fehérje adatbázis létezik, melyekkel összevethetjük a 
tömegspektrometriás adatainkat, pl.: Uniprot, SWISS-2D-PAGE, World-2DPAGE, PIR. A hat fehérje azonosítása, 
12 
M
w
(kD
a)(
2) 
M
w
(kD
a)(
2) 
AGRÁRTUDOMÁNYI KÖZLEMÉNYEK, 2012/50. 
 
 
 
abból a szempontból lesz nehézkes, hogy mindegyik csak kis mértékben expresszálódott, nehéz feladat ezeket a 
kis pontokat kivágni a gélből. A pontok méretét növelhetjük, ha nagyobb mennyiségű fehérjét viszünk fel az első 
dimenzióban az IPG stripekre, ez azonban együtt járhat azzal, hogy a fehérjepontok összeolvadnak, és így nem 
tudjuk újra detektálni ezt a hat fehérjét.  
 
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 
 
A publikáció elkészítését a TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024 számú projekt támogatta. A projekt az Európai 
Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. 
 
 
IRODALOM 
 
Burk, R. F.–Hill, K. E. (1993): Regulation of selenoproteins. Annual. Review Nutrition. 13: 65–81. 
Clark, L. C.–Combs, G. F.–Turnbull, B. W.–Slate, E. H.–Chalker, D. K.–Chow, J.–Davis, L. S.–Glover, R. A.–Graham, G. F.–Gross, E. G.–
Krongrad, A.–Lesher, J. L.–Park, K.–Sanders, B. B.–Smith, C. L.–Taylor, R. (1996): Effects of selenium supplementation for cancer 
prevention in patients with carcinoma of the skin. Journal of the American Medical Association. 276: 1957–1985. 
Gergely V. (2006): Fehérje-elválasztási módszerek bevezetése a szelén módosulat-analitikába. Budapesti Corvinus Egyetem. Alkalmazott 
Kémia Tanszék. Doktori értekezés. 
Lippolis, J. D.–Reinhardt, T. A. (2008): Centennial Paper: Proteomics in animal science. Journal of Animal Science. 86: 2430–2441. 
National Research Council (1994): Nutrient Requirements of Poultry, 9th rev. ed. National Academy Press. Washington. DC. 
Navarrro-Alarcon, M.–Cabrera-Vique, C. (2008): Selenium in food and the human body: A review. Science of the Total Environment. 400: 
115–141. 
Payne, R. L.–Lavergne, T. K.–Southern, L. L. (2005): Effect of inorganic versus organic selenium on hen production and egg selenium 
concentration. Poultry Science. 84: 232–237. 
Shevchenko, A.–Wilm, M.–Vorm, O.–Mann, M. (1996): Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. 
Analytical Chemistry.  68. 5: 850–858 
Thomson, C D. (2004): Assessment of requirements for selenium and adequacy of selenium status: a review. European Journal of Clinical 
Nutrition. 58: 391–402. 
Wang, Y-B.–Xu, B-H. (2007): Effect of different selenium source (sodium selenite and selenium yeast) on broiler chickens. Animal Feed 
Science Technology. 144: 306–314. 
Watanabe, T.–Kiron, V.–Satoh, S. (1997): Trace minerals in fish nutrition. Aquaculture. 151: 185–207. 
Zoidis, E.–Pappas, A. C.–Georgiou, C. A.–Komaitis, E.–Feggeros, K. (2010):Selenium affects the expression of GPx4 and catalase in the liver 
of chicken. Comparative. Biochemistry and Physiology. Part B. Biochemistry and Molecular Biology. 155. 3: 294–300. 
 
 
13 


Csirkemáj proteomjának változása szelén indukció hatására - 2D PAGE optimalizálás

https://dea.lib.unideb.hu/dea/bitstream/2437/160638/1/file_up_Gulyas%20Gabriella.pdf

Csirkemáj proteomjának változása szelén indukció hatására - 2D PAGE optimalizálás

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

University of Debrecen Electronic Archive