Thrombomodulin-dependent effect of factor VLeiden mutation on factor XIII activation, on the cross-linking of fibrin and alpha-2-plasmin inhibitor and its consequences on fibrinolysis
ÖSSZEFOGLALÁS
Az V-ös faktor Leiden mutációja (FVLeiden) egy relatíve gyakori mutáció a kaukázusi populációban, mely heterozigóták esetén 5-8-szoros, homozigótákban 50-80-szoros vénás tromboembóliás rizikót jelent. FVLeiden esetén az aktív FV (FVa) és a FV aktivált protein C (APC) indukálta proteolítikus hasítása gátolt, így a trombin generáció csökkenése elmarad és a prokoaguláns aktivitás down-regulációja, illetve a FV antikoaguláns hatása is gátolt. A FVLeiden trombin generáción túlmutató közvetett hatásai kevésbé ismertek, így pl. a mutációnak a XIII-as faktor (FXIII) aktivációra, az alvadék keresztkötéseinek kialakulására gyakorolt hatását eddig nem vizsgálták.
Munkánkban tizenöt egészséges, ismert FVLeiden genotípusú egyén plazmájában a véralvadás fiziológiás, extrinszik útját rekombináns humán szöveti faktort, foszfolipidet és Ca2+-ot tartalmazó oldattal aktiváltuk rekombináns humán trombomodulin (rhTM) jelenlétében és hiányában. A különböző időközökben nyert alvadékokat SDS-PAGE és Western blotting technikákkal analizáltuk, majd a FXIII aktiválódás, a fibrin keresztkötések illetve az alfa-2-plazmin inhibitor és fibrin közti keresztkötések kialakulásának mértékét kvantitatív denzitometriával értékeltük. Kísérleteinket tisztított, vad típusú FV-tel illetve homozigóta mutáns FVLeiden-nel kiegészített FV hiányos plazmákkal is elvégeztük. Az rhTM-nek a szöveti plazminogén aktivátorral (tPA) indukált alvadék lízisre kifejtett in vitro hatását turbidimetriás módszerrel vizsgáltuk FV vad típusú FVLeiden homozigóta egyénektől nyert plazmákban.
A FV vad típusú egyének plazmájában az rhTM jelentősen lelassította a FXIII aktivációját, a fibrin gamma-láncok dimerizációját illetve a alfa-2-plazmin inhibitor-fibrin gamma-lánc közti heterodimerek/oligomerek kialakulását. Az rhTM-nek ez a hatása FVLeiden hordozók esetében csak elhanyagolható mértékben érvényesült. Az rhTM lelassította a tPA-indukált alvadék lízisét és ez a hatás kifejezettebb volt a FVLeiden hordozó egyének plazmájában. Amennyiben a trombin által aktiválható fibrinolízis inhibitor aktív formájának (TAFIa) hatását karboxipeptidáz gátló szer hozzáadásával felfüggesztettük, rhTM jelenlétében a lízis idő a FV vad típusú plazmákban jelentősen megrövidült, ami a lassúbb alfa-2-plazmin inhibitor-fibrin keresztkötések kialakulásával magyarázható. Ez a hatás a FVLeiden hordozók esetében nem volt megfigyelhető.
A FVLeiden hordozók plazmájában az rhTM-nek a FXIII aktivációra, a fibrin láncok keresztkötésére, illetve a alfa-2-plazmin inhibitor-fibrin keresztkötések kialakulására kifejtett késleltető hatása nem érvényesül, és ez az alvadék fibrinolízisének gátlásához vezet. Eredményeink a FVLeiden mutáció trombózis hajlamot fokozó hatásának új biokémiai mechanizmusára világítanak rá.
SUMMARY
Factor V Leiden mutation (FVLeiden) mutation is common among Caucasians and it is associated with a 5-8-fold increased risk of venous thromboembolism in heterozygotes and with a 50-80-fold risk among homozygotes. FVLeiden is associated with an impaired down-regulation of the procoagulant activity exerted by activated FV and with the loss of FV anticoagulant function; hereby it compromises the down-regulation of thrombin generation. The downstream consequences of FVLeiden, which might be connected to increased thrombin generation, have been revealed only partially. The effect of FVLeiden on factor XIII (FXIII) activation, on the cross-linking of fibrin chains and alpha-2-plasmin inhibitor to fibrin has not been investigated.
In the plasma samples of fifteen healthy individuals with known FVLeiden genotype the physiological, extrinsic pathway of coagulation was initiated by recombinant human tissue factor, phospholipids and Ca2+ in the presence and absence of recombinant human thrombomodulin (rhTM). Clots were recovered after various time intervals, the extent of FXIII activation, fibrin cross-linking and alpha-2-plasmin inhibitor-fibrin cross-linking were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting, then quantified by densitometry. The experiments were also carried out using FV deficient plasma supplemented with purified wild type FV or FVLeiden. The effect of rhTM on tissue plasminogen activator (tPA) induced clot lysis was measured by turbid metric method.
RhTM significantly delayed the activation of FXIII, fibrin cross-linking and the formation of alpha-2-plasmin inhibitor-fibrin gamma-chain heterodimers/oligomers in the plasma from FV wild type individuals. This effect of rhTM was impaired in the presence of FVLeiden. RhTM delayed tPA-induced clot lysis and this effect of rhTM was more pronounced in plasma containing FVLeiden. When active thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFIa) was inhibited by carboxypeptidase inhibitor, rhTM accelerated clot lysis in the presence of wild type FV, which is explained by the delayed alpha-2-plasmin inhibitor-fibrin cross-linking. This effect of rhTM did not prevail in the presence of FVLeiden.
FVLeiden abrogates the delaying effect of rhTM on FXIII activation, on fibrin chain cross-linking and on alpha-2-plasmin inhibitor-fibrin cross-linking, which contribute to the impaired fibrinolysis. Our results reveal a novel mechanism that contributes to the increased thrombosis risk in FVLeiden carriers.N