Henner, J.

Horn, K.

Scriba, Peter Christian

German

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Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie e.V. M I T T E I L U N G E N INHALTSVERZEICHNIS Spezielle Klinisch-chemische Methoden K. Horn, J. Henner und P. C. Scriba: Klinisch-chemische Schilddrüsenfunktionsdiagnostik II. Automatisierter T3 - in vitro-Test 29 R. Wepler und H. Burkhardt: Die Bestimmung von Hydroxyprolin im Urin und in Geweben 34 Tagungsberichte Bericht über die Tagung „Biochemie und Klinische Chemie angeborener und erworbener Stoffwechseldefekte" vom 22.-24. Oktober 1970 in Bad Neuenahr 37 Bericht über das Merck-Symposium 1970 in Zusammenarbeit mit der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie: Auftrag der Klinik an das klinisch-chemische Laboratorium 38 Nachrichten für die Mitglieder der Gesellschaft Meßtemperatur 25°C bei Enzymaktivitätsbestimmungen 40 Ringversuch der Laboratorien 40 Ausschreibung des Schöller-Junkmann-Preises und des Marius-Tausk-Förderpreises 41 Ständige Kommissionen, Änderung der Kommission Fachnormenausschuß Medizin 41 ..Analytical Quality Control Services" der „Internationalen Atomenergie-Behörde" 41 Stellenausschreibung XXIII Wer bestimmt was? 42 Neues aus der Industrie Aquademat der Fa. Hecht, Sondheim Ionen-selektive Elektroden der Fa. Günter Schmidt. Hamburg Knauer-Dampfdruck-Osmometer 44 Tagungskalender IV Zeitschriftenübersicht IX - XIV u. XXVII - XXXVIII Current Contents Schmunzelecke XXXIX Herausgeber: Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie Schriftleitung: Prof. Dr. H. Schievelbein, 8 München 15, Nussbaumstraße 20, Telefon (08 11) 53 99 11 /632 Verlag und Anzeigen-Verwaltung: Karl Demeter, 8032 Gräfelfing, Würmstr. 13, Tel. (08 11) 85 23 33, Telex 05-24 068 delta d Druck: Wegele & Sohn, 8032 Gräfelfing, Irminfriedstraße 1, Tel. (08 11) 85 21 51 III Dt. Ges. f. Klin. Chemie e.V. - Mitteilungen 2/1971 Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie e.V. Mitteilungen Heft 2/1971 SPEZIELLE KLINISCH-CHEMISCHE METHODEN Klinisch-chemische Schilddrüsenfunktionsdiagnostik II. Automatisierter Ta- in vitro-Test* Von K. Horn, J. Henner und P. C. Scriba Laboratorien für Klinische Chemie und Endokrinologie der II. Medizinischen Klinik der Universität München 1. Prinzip der Methode Die Schilddrüsenhormone Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) sind im Serum zu über 99 % proteingebunden, aber nur der Anteil der freien Hormone, der nur einen Bruchteil von 1 % ausmacht, ist biologisch aktiv. Zur direkten Messung dieses freien Schilddrüsenhormonanteils wurden Dialyse-, Präzipitations- und Ultrazentrifugations-techniken beschrieben. Diese Verfahren sind aber technisch aufwendig und wurden bisher routinemäßig kaum eingesetzt. Zur indirekten Erfassung der Proteinbindung der Schilddrüsenhormone werden heute hauptsächlich die T 3 - in vitro-Tests benutzt. Diese Bestimmung wird als Ergänzung zur Messung des Gesamtschilddrüsenhormon-gehaltes im Serum (PB 1 2 7I oder Gesamt-Thyroxinbestimmung) unbedingt benötigt, wenn die schilddrüsenhormonbindenden Serumproteine verändert sind (1,2), wie ζ. B. bei Antiovulantienbehandlung etc. Allen T3- in vitro-Tests ist gemeinsam, daß nicht die tatsächliche Konzentration an freiem Trijodthyronin im Serum gemessen wird, sondern vielmehr die Verteilung des radioaktiv markierten Hormons zwischen den Serumproteinen einerseits und Ionenaustauschern, Dextrangel oder anderen Adsor-bentien andererseits. Bei uns hat sich die Dextrangelfiltration zur Bestimmung des proteingebundenen und sog. freien T3- 1 2 5 J bewährt (1,3). Wegen der ständig steigen­den Zahl der Anforderungen und zur besseren Standardisierung haben wir diese Methode automatisiert. Hierdurch wurde es bei uns möglich, wirtschaftlich günstig mehr als 100 Bestimmungen täglich von einer Technischen Assistentin durchführen zu lassen. *) Teil I (Bestimmung des proteingebundenen Jods im Serum (PB , 2 7 I ) s. Heft 5/1970 **) Gerät demnächst l ieferbar (Fa. Sartorius, Membranfi l ter GmbH, Göttingen) 29 Dt. Ges. f. Klin. Chemie e.V. - Mitteilungen 2/1971 2. Reagenzien: 1. Trijodthyronin-1 2 5Jod-Arbeitsstandard: 0,2 mCi Liothyronine-1 2 5! (Radiochemical Center Amersham, England) in ca. 1 ml 50%iger wäßriger Propylenglycol-Lösung, spezifische Aktivität 20-50 mCi/mg Ts, werden mit 0,06 Μ Natriumphosphatpuffer pH 7,4 auf 250 ml verdünnt. Diese Stan­dardlösung wird in Portionen im Kühlraum bei + 4 ° C aufbewahrt. 2. 0,05 Μ Natriumphosphatpuffer pH 7,4. 3. Sephadex G-25 fine (Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden). 4. Nachwaschserum: Rinderserum oder Serum von gesunden Personen. 3. Untersuchungsmateria!: Wie zur Bestimmung des PB 1 2 7I (2) wird in jodfreien Einmalröhrchen abgenommenes Blut nach vollständiger Gerinnung zentrifugiert. Das gewonnene Serum kann sofort oder später untersucht werden; bei - 25 °C kann es mehrere Monate aufbewahrt werden. 4. Geräte: Die Geräteanordnung ist schematisch in Abb. 1 dargestellt. *) Mit Hilfe einer Pro-portlonierpumpe (25-canal micro-pump der Fa. Ismatec, Zürich, Schweiz) wird simul­tan aus 20 Eppendorfgefäßen bzw. einem Vorratsgefäß Probe oder Elutionslösung angesaugt und im geschlossenen System über 20 Sephadex-Säulen (s. u.) gepumpt. Die Säulen stehen jeweils fest in Kupferhülsen, die mit Hilfe eines Umwälzthermo­staten von Wasser (27 °C) umspült und temperiert werden (Thermoblock). Die Säulen-eluate können jetzt über eine Abflußrinne verworfen oder fraktioniert, d. h. zeit­gesteuert in Einmalplastikröhrchen (22 χ 100 mm) gesammelt werden. Nach Ende der Chromatographie können die Röhrchen ohne einen Pipettierschritt gleich am auto­matischen Gammameßplatz (Gammaguard, Fa. Tracerlab, Köln) gezählt werden. 5. Durchführung der Bestimmung: I. Bereitung der Säulen: 5 ml-Einmalspritzen (Fa. Braun, Melsungen), vor deren durch Zentralverschluß verschlossenen Auslauf ein feinporiges Filtrierpapier (Fa. Sartorius, Göttingen) liegt, werden mit 1 g über Nacht in Wasser gequelltem Sephadex G-25 fine gefüllt. Nach Sedimentation des Gels wird die Oberfläche mit einem weiteren Filtrierpapier bedeckt. Die Säulen werden nun durch Anpressen der Deckplatte über Nadeln an die Pumpenschläuche angeschlossen (Abb. 1) und mit 0,05 Μ Natriumphosphatpuffer pH 7,4 äquilibriert und stabilisiert. Vor der ersten Chromatographie werden die jeweiligen Säulenüberstände abgesaugt. Die Säulen sind jetzt über mehrere Wochen verwendbar. II. Inkubationsgemisch: 0,2 ml Serumprobe, 0,2 ml 0,05 Μ Natriumphosphatpuffer pH 7,4 und 0,2 ml T3-1 2 5J-Arbeitsstandard werden 15 min in Eppendorf-Gefäßen bei Zimmertemperatur im Rotationsmischer (Netheler und Hinz, Hamburg) inku­biert. III. Chromatographie und Fraktionssammeln: Von dem Inkubationsgemisch (Σ V = 0,6 ml) werden mit der Proportionierpumpe jeweils in 1 min 0,42 ml (±0,02) angesaugt. Danach wird 10 min mit Puffer nach­gespült. Auf den Säulen erfolgt jetzt die Auftrennung des Inkubationsgemisches in 3 Fraktionen (3): a) Der proteingebundene Anteil des T s - 1 2 5 J und b) der 1 2 5 Jodid-anteil - als Verunreinigung des T 3 - 1 2 5 J , dessen prozentualer Anteil je nach Alter 30 Dt. Ges. f. Klin. Chemie e.V. - Mitteilungen 2/1971 der Lösung zwischen 2 und 5 % liegt, - werden in den ersten Röhrchen (I) gesam­melt; c) Das Dextrangel-gebundene T 3 - 1 2 5 J (sog. freies T 3 - 1 2 5 J ) wird durch Nach­waschen mit einem Überschuß von Rinder- oder Humanserum (2 min entsprechend 0,84 ml) quantitativ von den Säulen eluiert und in den dritten Röhrchen (III) auf­gefangen. Zur Kontrolle der ausreichenden Trennung der Gipfel wird das nahezu aktivitätsfreie Intervall zwischen den beiden Fraktionen gesammelt (Röhrchen II). Die Zeit zwischen Start und Ende dieses gesamten Chromatographieschrittes liegt bei 25 min. IV. Berechnung: Die Proben werden bei einer Zeitvorwahl von 30 sec gezählt. Der statistische Zählfehler kann wegen der jeweiligen Impulsraten von über 10 000 ausreichend niedrig gehalten werden. Das sog. freie T3 - 1 2 5 J wird nun in Prozent des Gesamt-T3- 1 2 5J berechnet; dieses ergibt sich aus der Summe der Impulsraten von Röhrchen I, II und III unter Subtraktion des errechneten 1 2 5Jodidanteils, der in einem getrennten Versuch ermittelt wurde (3). Aus Zeitersparnisgründen wird zur Berechnung bei uns ein programmierbarer Tischcomputer (Programma Ρ 102, Fa. Olivetti) eingesetzt. Neben der Qualitätskontrolle (s. u.) können durch Ver­gleich der jeweiligen Gesamtaktivitäten und Kontrolle der nahezu aktivitätsfreien Intervalle zwischen den Peaks Fehlbestimmungen auf Grund technischer Fehler nahezu ausgeschlossen werden. 6. Ergebnisse: Die Präzision der Methode wurde über ein Jahr lang mit einem gepoolten Kontroll­serum geprüft. Bei einem Mittelwert χ = 38,0 % und einer Standardabweichung s = 1,32% berechnet sich ein Variationskoeffizient von VK = 3,47%. Der Normalbereich (χ ± 2 s) gesunder Probanden (N = 130) zeigt eine Normalver­teilung und liegt zwischen 32 und 42 % (Abb. 2). Die diagnostische Wertigkeit des beschriebenen T3-in vitro-Tests wurde an einem ausgewählten Kollektiv von Hypo- und Hyperthyreosen untersucht und ist in Abb. 2 aufgezeigt. 7. Störfaktoren: Die Störfaktoren bei den T3-in vitro-Tests sind aus der Literatur hinreichend bekannt (1,2). Ein erniedrigtes sog. freies T 3 - 1 2 5 J ohne Vorliegen einer Hypothyreose findet sich hauptsächlich bei Gravidität, unter Östrogen- oder Antiovulantienbehandlung. Die Ursache falsch erhöhter Werte sind vor allem Dysproteinämien und Behandlung mit bestimmten Medikamenten (Salicylate, Diphenylhydantoin, Phenylbuzaton etc.). Durch gleichzeitige Bestimmung des PB 1 2 7I und des sog. freien T 3 - 1 2 5 J läßt sich durch Multiplikation dieser beiden Werte der Index der freien Schilddrüsenhormone be­rechnen, der in den meisten Fällen die richtige Diagnose der Schilddrüsenfunktion erlaubt. Das ist der sog. Clark-Horn-Index (4), dessen Normalbereich bei uns zwischen 1,33 jwg/100 ml und 2,50 (wg/100 ml liegt. Dieser Wert verhält sich mit hinreichender Genauigkeit analog zum gemessenen Wert des absoluten freien Thyroxins (5). 31 Dt Ges. f. Klin. Chemie e.V. - Mitteilungen 2/1971 4 Β C Ε G | Η D I J Abbildung 1 a und b: Schematische Darstellung des automatisierten T3-in vitro-Test-gerätes, a: Seitenansicht, b: von oben A = Puffer-Vorratsgefäß Β = Inkubationsgefäß C = Proportionierpumpe D = Dextrangelsäule Ε = Zentralverschluß (Zulauf) F = Zentralverschluß (Auslauf) G = Filtrierpapier Η = Thermoblock I = Fraktionsröhrchen J = Abflußrinne (Spülen) 32 Dt. Ges. f. Klin. Chemie e.V. - Mitteilungen 2/1971 % sog. freies T 3 -1 2 5 J >70 70 60 -50 -40 -30 -20 J Abbildung 2: Diagnostische Wertigkeit des automatisierten Ta-in vitro-Tests 8. Literatur: 1. Scriba, P. C : Schilddrüsenkrankheiten. In: K. Schwarz und P. C. Scriba, Endo­krinologie für die Praxis, Lehmann, München, 1970 2. Horn, K., P. C. Scriba: Klinisch-chemische Schilddrüsenfunktionsdiagnostik. I. Bestimmung des proteingebundenen Jods im Serum (PB 1 2 7I). Dtsch. Ges. Klin. Chem., Mitteilungen 1970 (5) 3 3. Scriba, P. C, R. Landgraf, H. G. Heinze, K. Schwarz: Bestimmung der Bindung von Trijodthyronin an Serumprotein mittels Dextrangelfiltration. Klin-Wschr. 44 (1966) 69 4. Clark, F., D. B. Horn: Relationship between serum protein bound iodine and resin uptake of 1 3 1l-triiodothyronine. J. clin. Endocr. 26 (1966) 352 5. Rosenbaum, J. M., A. F. Krieg, J. B. Henry, J. M. Mozley, J. G. Mc Afee: Thyroid function evaluation in patients with increased or decreased thyroxine-binding protein. Amer. J. clin. Pathol. 50 (1968) 336 Anschrift der Verfasser: Dr. med. Klaus Horn Jürgen Henner PD Dr. med. Peter C. Scriba II. Medizinische Klinik der Universität 8 München 15, Ziemssenstraße 1 HYPO -Τ H Y R E O S E N HYPER -T H Y R E O S E N ο ο ° o ο ο o ° o 8 ° ο °o ο ° 0 o OqoO o ° o W/MM EREICH^o oWM/A mm ·· ·· • x*-s 28,6 i 2,7 N=15 x i s 57,5110,9 N=31 33 

Klinisch-chemische Schilddrüsenfunktionsdiagnostik

Universität München: Elektronischen Publikationen

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