Etude de la transformation plasmidique naturelle d'Escherichia coli et de ses relations éventuelles avec la compétence programmée pour la transformation génétique et la compétence dite nutritionnelle
Bien que la bactérie Escherichia coli ne soit pas connue pour être naturellement transformable, mon travail de thèse montre que l'on peut obtenir des transformants plasmidiques spontanément sur boîte. Cette transformation n'est pas induite par les cations divalents au contraire de la transformation ‘artificielle chimique’ (Sun et al., FEMS Microbiol. Lett. 2006. 265: 249–255). Les bactéries transformables utilisent une machinerie protéique transmembranaire, évolutivement conservée, pour internaliser l'ADN exogène sous forme simple brin. E.coli possède l'ensemble des gènes codant pour cette machinerie. J'ai inactivé les gènes clés de cette machinerie, dont hofQ (canal transmembranaire externe) et ycaI (canal transmembranaire interne), et observé qu'aucun de ces mutants n'est affecté pour la transformation sur boîte. L'ADN plasmidique ne pénètre donc pas via la machinerie de transformation, mais plutôt sous forme double brin ce que suggèrent les courbes de réponse à la concentration d'ADN (Sun et al., J. Bacteriol. 2009. 191: 713-719). Le troisième volet de ma thèse a consisté à tenter de mieux caractériser un phénomène appelé 'compétence nutritionnelle', appellation qui désigne la capacité d'utiliser l'ADN comme source de carbone. Pour établir si différents gènes de la machinerie de transformation étaient impliqués, j'ai cherché à reproduire les expériences publiées de croissance de la souche ZK126 sur milieu minimum M63 contenant de l'ADN. Malgré de nombreuses tentatives et contrôles, je n'ai pas pu reproduire ces expériences, ce qui m'a amené à clore mon mémoire de thèse par une discussion critique des données publiées relatives à la compétence nutritionnelle de E. coli.While Escherichia coli is not considered to belong to naturally transformable species, I established a transformation system allowing spontaneous plasmid transformation on plate (Sun et al., FEMS Microbiol. Lett. 2006. 265: 249–255). Transformation is not induced by divalent cations in contrast to chemically-induced 'artificial transformation' (Sun et al., J. Bacteriol. 2009. 191: 713-719). As DNA uptake in naturally transformable bacteria relies on a conserved multiprotein machinery and the E. coli genome contains all genes encoding this machinery, I investigated whether key genes are required for plasmid transformation. None of the mutants I constructed, including hofQ and ycaI which encode putative outer and inner membrane channel proteins were affected, indicating that plasmid DNA is not taken up via the transformation machinery. We proposed that plasmid DNA instead enters the cytoplasm as double stranded material as suggested by response curves to DNA concentration (Sun et al., J. Bacteriol. 2009. Ibid.). In the last part of my thesis, I reinvestigated so-called ‘nutritional competence’ of E. coli. Previously work reported that E. coli cells are able to use DNA as the sole carbon source. I wished to establish whether this phenomenon relies on the above-mentioned DNA uptake machinery. I therefore tried to reproduce the published growth experiments of E. coli ZK126 on M63 minimal medium with DNA. Despite numerous attempts and controls, I could not observe any growth. This failure to reproduce published observations led me to conclude my thesis by an in-depth discussion of the three articles dedicated to so-called nutritional competence of E. coli
