澤 文

筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences2017【要旨】thesi

澤, 文

194242

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路とcAMP経路の関係について著者 澤 文発行年 2017学位授与大学 筑波大学 (University of Tsukuba)学位授与年度 2017報告番号 12102甲第8417号URL http://hdl.handle.net/2241/00152562-１   氏     名 澤 文 A学 位 の 種 類       EA 博士（医学） A学 位 記 番 号       EA 博甲第   ８４１７   号 A学位授与年月       EA 平成 ２９年 １２月 ３１日 A学位授与の要件       EA 学位規則第４条第１項該当 A審 査 研 究 科       EA 人間総合科学研究科 A学位論文題目       EA 分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路と cAMP経路の関係について A主 査       EA     筑波大学教授 博士（理学） 入江 賢児 A副 査       EA   筑波大学准教授 博士（医学） 坂下 信悟 A副 査       EA   筑波大学准教授 博士（医学） 坂田 麻実子  副 査       EA   筑波大学准教授 博士（医学） 鈴木 浩明  論文の内容の要旨   澤 文氏の博士学位論文は、分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路と cAMP経路の関係について検討したものである。その要旨は以下の通りである。  （目的）  分化型甲状腺癌には、他臓器癌で一般的にみられる癌遺伝子の異常があり、細胞増殖の主要なシグナル伝達経路であるMAPキナーゼ経路が活性化されている。それにも関わらず分化型甲状腺癌は、他臓器癌に比べ細胞増殖が遅く進行が緩徐である。最近、甲状腺癌に対する分子標的薬として sorafenib やlenvatinibが本邦で承認された。両分子標的薬の作用機序は、RET、VEGF、PDGFなどのチロシンキナーゼ型受容体と、その下流のMAPキナーゼ経路を阻害することにより、腫瘍の細胞増殖や血管新生を抑制することにある。生理的に甲状腺濾胞細胞は、Thyroid stimulating hormone (TSH) 受容体の刺激により cAMPを介するシグナル伝達経（cAMP経路）が活性化され、細胞増殖とホルモン分泌亢進が起こる。そのため甲状腺癌の治療では、一般的に TSH の抑制が行われる。しかし、甲状腺癌培養細胞を用いた実験では、cAMP経路の活性化は、細胞増殖を抑制することが報告されている。その機序としては、cAMP経路の活性化がMAPキナーゼ経路の阻害するためであるという報告がある。  本研究で著者は、分化型甲状腺癌の培養細胞において、sorafenibでMAPキナーゼ経路を抑制した場合と、forskokinで cAMP経路を活性化した場合の細胞増殖の抑制作用を解析し、分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路と cAMP経路の関係を検討した。  （対象と方法）  著者は、分化型甲状腺癌細胞として、乳頭癌由来の TPC-1(RET/PTC再構成)、KTC1(BRAF V600E変異)および甲状腺濾胞癌由来の WRO(BRAF V600E変異)を用いた。sorafenib と forskokin の両者の作用-２ をWST-8法で経時的（24、48、72、96時間）に比較解析した。WROについては 3次元培養用下においても sorafenib および forskolin の細胞増殖に対する作用を WST-8 法による解析を行った。さらにsorafenibと forskokinのMAPキナーゼ経路への影響について、リン酸化 ERKの発現をウェスタンブロットにて解析した。また、細胞周期への影響について、ウェスタンブロットによるリン酸化 RB、 CDK4、 cyclin D1の発現解析およびフローサイトメトリーによる細胞周期解析を行った。  （結果） いずれの細胞株でも 72 時間後から sorafenib 単独と比較して、sorafenib と forskolin 併用およびforskolin単独で細胞増殖の低下がみられた。ただし、sorafenibと forskolin併用と forskolin単独との間には有意差がみられなかった。3 次元培養下での WRO の細胞増殖は sorafenib 単独では低下しなかったが、forskolin単独で 1/3程度に低下し、さらに forskolinと sorafenibの併用で低下する傾向がみられた。ウェスタンブロットの結果、TPC-1、KTC1、WROいずれの細胞株でも sorafenib単独あるいは sorafenib と forskolin併用では ERKのリン酸化が抑制された。しかしながら、forskolin単独ではERKのリン酸化の抑制は起こらなかった。一方、forskolin単独では、いずれの細胞株においても ERKのリン酸化に影響は及ぼさなかった。細胞周期への影響としては、cyclin D1は TPC-1とWROでは、forskolin単独および sorafenibと forskolinの併用で低下を認めたが、sorafenib単独では低下しなかった。KTC-1については、forskolin単独では cyclin D1の低下はみられなかったが、sorafenibと forskolinの併用では TPC-1, WROと同様に発現低下が見られた。一方で、リン酸化 RBおよび CDK4に関しては sorafenib単独、sorafenibと forskolinの併用で発現の低下がみられたが、forskolin単独では明らかな発現低下はみられなかった。フローサイトメトリーの結果、3つの細胞株においていずれも sorafenibおよび forskolinによる細胞周期への影響にバリエーションがみられたが、sorafenibは S期の割合を増加させる傾向があり、一方で forskolinは G2/M期の割合を増加させる傾向がみられた。   (考察)  以上の結果から、著者は、MAP キナーゼ経路が活性化されている高分化型甲状腺癌の培養細胞において、MAPキナーゼ経路を阻害する sorafenibより、アデニル酸シクラーゼを活性化する forskolinの方が、強力な細胞増殖抑制作用を示した。ウェスタンブロットの結果から、その作用機序には、MAPキナーゼ経路の抑制とは別の経路が関与すると考えた。cAMP経路の活性化が分化型甲状腺癌の細胞増殖抑制に重要であることが示された。  審査の結果の要旨 （批評）  本研究では、分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路と cAMP経路の関係について検討され、MAPキナーゼ経路が活性化されている高分化型甲状腺癌の培養細胞において、MAPキナーゼ経路を阻害する sorafenibより、アデニル酸シクラーゼを活性化する forskolinの方が、強力な細胞増殖抑制作用を示すことが示された。その作用機序には、MAPキナーゼ経路の抑制とは別の経路が関与し、cAMP経路の活性化が分化型甲状腺癌の細胞増殖抑制に重要であることが示された。これらの本研究成果は、分化型甲状腺癌の細胞増殖の制御機構、治療法を明らかにする上で重要な知見であり、高く評価される。  平成 29 年 10 月 31 日、学位論文審査委員会において、審査委員全員出席のもと論文について説明を求め、関連事項について質疑応答を行い、最終試験を行った。その結果、審査委員全員が合格と判定した。  よって、著者は博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと認める。   

分化型甲状腺癌の細胞増殖におけるMAPキナーゼ経路とcAMP経路の関係について

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