Grskovic, Ivan

German

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Kurzzusammenfassung  In vitro Studien lassen vermuten, daß Annexine in kalziumabhängiger Weise Matrixvesikel und extrazelluläres Kollagen X binden und über ihre postulierte Kalziumkanalfunktion den Influx von Kalziumionen in die Vesikel regulieren. Bisher konnte dieses Mineralisierungs-modell in vivo jedoch nicht bestätigt werden, da gendefiziente Mäuse für die Annexine AnxA5 und AnxA6 keine offensichtlichen Störungen in der Skelettentwicklung und Kalzifizierung der Röhrenknochen aufwiesen. Auf Grund ihrer ähnlichen Proteinstruktur und funktionalen Eigenschaften könnte das Fehlen des jeweiligen Annexins durch das noch vorhandene Annexin kompensiert werden. Zur Untersuchung der Relevanz von Annexin-Kollagen Wechselwirkungen für die Knorpelkalzifizierung in vivo wurden daher Mausstämme etabliert, denen die einzelnen Annexine AnxA5 oder AnxA6, beide Annexine, Kollagen X oder alle drei Proteine gleichzeitig fehlen. Die Skelettentwicklung wurde in neugeborenen, juvenilen und adulten Mäusen mittels histochemischer, immunohistologischer, computertomographischer sowie ultrastruktureller Methoden detailliert analysiert. In Neugeborenen konnten im Skelettaufbau keine Unterschiede zwischen Wildtyp-Mäusen und Mutanten festgestellt werden. Die Verteilung der von Kossa angefärbten Mineral-ablagerungen in Paraffinschnitten der Hinterbeine der Mutanten unterschied sich nicht von Wildtyp-Tieren. Allerdings war in Col10(-/-)  und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Tieren die Fläche der prähypertrophen/hypertrophen Wachstumsfugenzone im Vergleich zu Wildtyp- und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäusen vergrößert und die Anzahl der Chondrozyten signifikant erhöht. In histochemisch angefärbten Paraffinschnitten der Femora von juvenilen zwei Wochen, sowie ein Monat alten Col10(-/-) und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Tieren konnte dieser  Effekt  jedoch  nicht  mehr  beobachtet  werden.  Die  Verteilung  von  Proteoglykanen,  Kollagenen  (II,  X  und  IX),  COMP  und  Matrilin  3  in  der  extrazellulären  Matrix  der  Wachstumsfuge unterschied sich in allen untersuchten Mutanten nicht von Wildtyp-Kontrolltieren. Periphere quantitative Computertomographie Messungen der Femora von ein Monat und ein Jahr alten mutanten Mäusen zeigten keine Veränderungen in der Mineralisierung, jedoch wiesen Col10(-/-) und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Mäuse einen verringerten peri- und endostealen Umfang des diaphysialen Kortikalknochens auf.  Durch ultrastrukturelle Analyse der Wachstumsfugen juveniler mutanter Tiere konnten keine auffälligen Abweichungen in der Morphologie und Verteilung der Matrixvesikel nachgewiesen werden. Mögliche kompensatorische Wirkungen durch differentielle Expression der verbleibenden Annexine konnten mit Hilfe von quantitativer PCR- und Microarray-Analysen in Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Tieren auf RNA-Ebene ausgeschlossen werden. Mittels Durchflusszytometrie wurden geringfügige Unterschiede in der Anzahl reifer IgM+/IgD+ B-Zellen des Knochenmarks in ein Monat alten mutanten Tieren nachgewiesen. Deren Zellzahlen waren sowohl im Knochenmark als auch in der Milz von ein Jahr alten Col10(-/-) und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Tieren   deutlich  erhöht.   Die  Menge  an  CD4+  T-Helferzellen  und  CD8+ zytotoxischen  T-Zellen  war  in  der  Milz  von  ein  Monat  sowie  ein  Jahr alten Col10(-/-) bzw. Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Mäusen signifikant verändert. Diese Analyse bestätigte, daß geringfügige Veränderungen der Chondrozytendifferenzierung, wie am Beispiel der Kollagen X geninaktivierten Mäuse gezeigt, Auswirkungen auf die Knochenarchitektur und sekundär auf die Blutzellenbildung im Knochenmark zur Folge haben können. Das Modell der Annexin-Kollagen vermittelten Mineralisierung konnte jedoch nicht bestätigt werden, da das Fehlen der Annexine AnxA5 und AnxA6 keine Verschlechterung des Phänotyps in Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) Mäusen hervorrief. Folglich belegt diese Arbeit die Bedeutung des Kollagen X für die enchondrale Ossifikation und hämatopoetische Differenzierung, während sie die Relevanz der Annexine AnxA5 und AnxA6 für diese Prozesse in Frage stellt.  

Die Bedeutung von Annexin-Kollagen X Interaktionen für die enchondrale Ossifikation und Hämatopoese

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