Lu, Xunli

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Kölner UniversitätsPublikationsServer

     Genetic Analysis of  Plant Innate Immunity          Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln  vorgelegt von  Xunli Lu  aus Wuhan, China     Köln, Oktober 2010  2 Die vorliegende Arbeit wurde am Max-Planck-Institut für Pflanzenüchtungsforschung in Köln in der Abteilung für Molekulare Phytopathologie (Direktor: Prof. Dr. P Schulze-Lefert) angefertigt.                                                                  Berichterstatter:   Prof. Dr. Paul Schulze-Lefert                 Prof. Dr. Marcel Bucher     Prof. Dr. Thorsten Nürnberger  Prüfungsvorsitzender:   Prof. Dr. Ute Höcker  Tag der mündlichen Prüfung:  25th November 2010   3 Summary Plants detect microbe associated molecular patterns (MAMPs) and trigger immune responses to restrict the growth of microbes. The Arabidopsis Leucine-rich repeat receptor-like kinases EFR and FLS2 respectively recognize bacterial MAMPs EF-Tu and flagellin (and their epitopes elf18 and flg22). The molecular basis of MAMP-triggered immunity is largely unknown. We isolated “priority in sweet life” (psl) mutants that are impaired in elf18-induced, but not flg22-induced signaling through forward genetic screens. These psl mutants exhibit hyper-susceptibility to a virulent bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). We showed that PSL2 encodes an endoplasmic reticulum (ER) lumen-localized enzyme UDP-glucose: glycoprotein glycosyltransferase and that PSL4 and PSL5 encode the Glucosidase II (GII) β and α subunit respectively. Mutant variants of STT3A, a key unit of the oligosaccharyltransferase complex, are also elf18-insensitive. STT3A, UGGT and GII are all highly conserved enzymes in eukaryotes. STT3A and GII regulate the N-glycosylation of membrane-localized proteins that are subsequently subject to folding and maturation through the calnexin/calreticulin-UGGT cycle. EFR steady-state levels, receptor ligand binding activity, and EFR signaling outputs are impaired in strong psl2, psl4 and stt3a mutants. These data demonstrated that EFR is a client of the ER protein quality control system. EFR signaling is partially and differentially impaired in two weakly dysfunctional gIIa alleles, psl5-1 and rsw3, which retain wildtype-like EFR steady-state levels. Interestingly, rsw3 plants exhibit supersusceptibility to Pst DC3000 despite a nearly intact co-activation of MAPKs, reactive oxygen species and callose deposition in response to elf18. This indicates those signaling outputs are insufficient to mount effective immunity. rsw3 plants fail to maintain high transcript levels of WRKY, PR1, PR2 and PROPEP genes at late time points after elf18 elicitation. These date point to the importance of sustained MAMP receptor signaling as a key step in the establishment of robust immunity. We further observed that psl2; psl4 and psl5, but not efr, mutant plants show a swollen root phenotype under high sucrose conditions, indicating the existence of another client protein than EFR that maintains root integrity upon abiotic stress. Our findings identify the ER-resident protein quality control system as a convergence point of biotic and abiotic stress responses in plants (Chapter 1).   4 Plants exhibit non-host resistance to non-adapted pathogens. Arabidopsis non-host resistance to non-adapted powdery mildew fungi involves both pre-invasive and post-invasive defense responses. Pre-invasive defense mediated by PEN1, PEN2 and PEN3 restricts fungal entry into leaf epidermal cells. EDS1, PAD4 and SAG101 function redundantly in post-invasive defense to limit subsequent invasive fungal growth that is terminated coincident with a host cell death response. To identify novel components in post-invasive non-host resistance, a mutational screen was performed using the EMS-mutagenized pen2-1 mutant line. The mutant enhancer of pen (epen) shows enhanced epiphytic hyphal growth of both Erysiphe pisi (E. pisi) and Blumeria graminis f sp. hordei (B. graminis), the pea and barley powdery mildew respectively, and in which the host cell death response is delayed compared to pen2 single mutants. An Arabidopsis whole genome re-sequencing approach was combined with a map-based cloning strategy to identifiy a candidate EPEN gene encoding a protein with a vacuolar protein sorting-associated protein domain. To validate the candidate EPEN, we crossed pen2-1 plants with T-DNA insertion mutants of this gene. In future work we will analyze the inoculation phenotype of E. pisi and B. graminis on the resulting double mutants (Chapter 2).  Plant disease resistance (R) proteins recognize avirulence (Avr) effectors of pathogens and trigger immune responses that are typically associated with a hypersensitive cell death response.  The barley MLA protein confers race-specific resistance to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f sp. hordei (Bgh). Previous gel filtration experiments of barley leaf protein extracts revealed that the 105 kDa monomeric MLA1-HA forms in planta ~300-400 kDa complexes. To identify putative components present in MLA1-HA complexes in planta, we optimized the co-immunoprecipitation (Co-IP) conditions suitable for mass spectrometry (MS) analysis. HA peptides in an elution buffer containing MS compatible detergent efficiently eluted MLA1-HA without IgG contamination. However, preliminary MS analysis failed to detect peptide sequences of MLA1-HA, indicating the need of further protocol modifications (Chapter 3).  A European consortium including research groups at the MPIPZ, Germany, has recently establishes an annotated Bgh genome assembly. In this work, I have contributed to the annotation of the Bgh geome. We analyzed the annotated gene  5 models for those encoding putative effector proteins. Among 225 candidates for secreted effector proteins (CSEPs), the largest group represents a family of RNAse-like proteins. CSEP sequence similarity analysis revealed the existence of at least 14 additional CSEP families. The sequence alignments will be useful for future functional characterization of Bgh effector candidates (Chapter 4).   6  Zusammenfassung Pflanzen erkennen Mikroben-assoziierte molekulare Signaturen (MAMS) und initiieren eine Immunantwort um die Ausbreitung von Mikroben einzuschränken. Die Arabidopsis Rezeptor-Kinasen EFR und FLS2 erkennen die bakteriellen MAMS EF-Tu, beziehungsweise Flagellin (sowie ihre Epitopen elf18 und flg22). Die molekulare Grundlage dieser MAMS-initiierten Immunität ist größtenteils unbekannt. Durch eine genetische Sichtung identifizierten wir „priority in sweet life“ (psl) Mutanten, die eine beeinträchtigte Erkennung von elf18, aber nicht flg22, zeigen. Diese psl Mutanten sind gegenüber dem virulentem Bakterium Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) anfälliger als Wildtyp-Pflanzen. PSL2 kodiert für das im Endoplasmatischem Reticulum (ER) lokalisierte Enzym UDP-glucose::glyoprotein glycosyltransferase (UGGT), PSL4 und PSL5 kodieren für die Glucosidase II (GII) β, beziehungsweise α Untereinheiten. Mutanten von STT3A, einer wichtigen Untereinheit des Oligosaccharyltransferase Komplexes sind ebenfalls insensitiv für elf18. STT3A, UGGT und GII sind hochkonservierte Enzyme in Eukaryoten. STT3A und GII regulieren die N-Glykosylierung von Membran-lokalisierten Proteinen, die anschließend zur Faltung und Reifung in den calnexin/calreticulin-UGGT Zyklus gelangen. In starken psl2, psl4 und stt3a Mutanten sind die EFR Akkumulation, Liganden-Bindung von EFR und EFR-induzierte Antworten stark beeinträchtigt. Diese Daten zeigen, dass EFR ein Klient der ER-lokalisierten Protein Qualitätskontrolle ist. In zwei schwach dysfunktionalen Allelen, psl5-1 und rsw3, die unveränderte EFR Akkumulation aufweisen, sind die Antworten von EFR partiell und differentiell beeinträchtigt. Interessanterweise sind rsw3 Pflanzen trotz der annähernd intakten elf18-induzierten Co-Aktivierung von MAPKs, reaktiven oxidativen Spezies und Callose Anlagerung, gegenüber Pst DC3000 enfälliger als Wildtyp-Pflanzen. Dies impliziert, dass diese induzierten Antworten unzureichend sind, um eine effektive Immunität aufzubauen. rsw3 Pflanzen können die elf18-induzierten Transkript-Akkumulation von WRKY, PR1, PR2 und PROPEP Genen nicht über längere Zeiträume aufrechterhalten. Diese Daten zeigen die Bedeutung einer anhaltenden MAMS-Rezeptor Aktivierung für die Ausführung einer robusten Immunantwort. Desweiteren stellten wir fest, dass psl2, psl4 und psl5, jedoch nicht  7 die efr Mutanten eine angeschwollene Wurzel in der Gegenwart hoher Saccharose Konzentrationen aufwiesen. Dies weist auf die Existenz eines anderen Klienten-Proteins als EFR hin, das für die Aufrechterhaltung der Wurzel-Integrität bei abiotischem Stress zuständig ist. Unsere Ergebnisse identifizieren die ER-lokalisierte Protein-Qualitätskontrolle als einen Knotenpunkt für biotische und abiotische Stress-Antworten in Pflanzen (Kapitel 1).   Pflanzen weisen Nichtwirts-Resistenz gegen nichtadaptierte Pathogene auf. In Arabidopsis beinhaltet die Nichtwirts-Resistenz gegen Mehltau sowohl prä- als auch post-invasive Abwehrreaktionen. Die prä-invasive Abwehr wird durch PEN1, PEN2 und PEN3 vermittelt, welche den Eintritt des Pilzes in die Blattepidermiszellen begrenzen. EDS1, PAD4 und SAG101 haben eine redundante Funktion in der post-invasiven Abwehr, die mit einem Wirtszelltod korreliert, und invasives Pilzwachstum begrenzt. Zur Identifizierung von neuen Komponenten der post-invasiven Abwehr wurde eine genetische Sichtung der EMS-mutagenisierten pen2-1 Mutantenline durchgeführt. Die Mutante enhancer of pen (epen) weist ein erhöhtes epiphytisches Hyphenwachstum des Erbsen- sowie Gerste-Mehltau, Erysiphe pisi bzw. Blumeria graminis f sp. hordei, auf, in der ein verzögerter Wirtszelltod beobachtet wurde. Durch eine Arabidopsis Genom-Resequenzierung in Verbindung mit einer DNA Marker-gestützten Genisolierung haben wir ein Kandidaten-Gen für EPEN identifiziert, das für ein Protein mit einer ‚vacuolar protein sorting-associated’ Proteindomäne kodiert. Zur Bestätigung des EPEN Kandidaten-Gens kreuzten wir eine T-DNA Insertionsmutante dieses Gens mit pen2-1 Pflanzen, um zukünftig den Infektionsphänotyp der Doppelmutante mit E. pisi und Bgh untersuchen zu können (Kapitel 2).     Pflanzen besitzen Resistenzproteine, die Avirulenz (Avr) Effektoren des Pathogens erkennen und eine Immunantwort einleiten, die in der Regel mit einem programmiertem Zelltod einhergeht. Das MLA R-Protein aus Gerste vermittelt rassenspezifische Resistenz gegen den Gerste-Mehltaupilz Blumeria graminis f sp. hordei (Bgh). Mittels Gelfiltration wurde in vrohergehenden Arbeiten ein MLA1-HA Komplex von ca. 300–400 kDa nachgewiesen. Zur Isolierung der mutmasslichen Komplexkomponenten haben wir die Bedingungen für die Co-Immunopräzipitation (Co-IP) für anschließende massenspektrometrische Analysen optimiert. Durch das  8 Verwenden von einem Elutionspuffer mit HA Peptiden und einem für die Massenspektrometrie (MS) kompatiblen Detergenz konnte das MLA1-HA Protein effizient und ohne IgG Kontamination eluiert werden. Jedoch konnten bisher mittels MS Analyse keine MLA1-HA Peptidsequenzen detektiert werden. Daher sind in Zukunft weitere Protokollmodifikationen erforderlich (Kapitel 3).  Das Genom des Gerste-Mehltaupilzes Bgh wurde durch ein europäisches Konsortium einschliesslich von Forschungsgruppen des MPIPZ in Deutschland sequenziert. Die Annotierung  des Genomes erfolgte automatisch sowie manuell. Ich habe zu diesem Projekt einen Teil der annotation beigesteuert. Die annotierten Genmodelle wurden im Hinblick auf mutmaßliche Effektorproteine untersucht. Darunter bilden die RNase-ähnlichen Proteine eine große Gruppe der insgesamt 225 candidates for secreted effector proteins (CSEPs). Zusätzlich haben wir weitere 14 CSEP Familien aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit identifiziert. Die Sequenzinformationen werden in Zukunft für die funktionale Charakterisierung der Effektorkandidaten nützlich sein (Kapitel 4).        

Genetic Analysis of Plant Innate Immunity

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