Das mit der Folat-sensitiven fragilen Stelle FRAXA assoziierte fragile X mentale Retardierung Gen 1 (FMR1) liegt auf dem menschlichen X-Chromosom (Xq27.3). Die instabile Amplifikation einer 5'-(CGG)n-3' Repetition in der 5'-nicht-translatierten Region des ersten Exons des FMR1 Gens kann zu drei phänotypisch verschiedenen Krankheiten führen, zur fragilen X assoziierten vorzeitigen Ovarialinsuffizienz, zum fragilen X assoziierten Tremor/Ataxie Syndrom und zum fragilen X Syndrom (FXS).
Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erstmals eine deutliche Methylierungsgrenze in einem Bereich von 650 bis 800 Nukleotiden stromaufwärts der 5'-(CGG)n-3' Repetition des FMR1 Gens aufgezeigt werden. Diese durch Bisulfit-Sequenzierung identifizierte Methylierungsgrenze ist konserviert und kommt unabhängig vom Alter, Geschlecht und Entwicklungsstadium in allen menschlichen Zelltypen und Zelllinien vor. Die Übergangsregion der Methylierungsgrenze im 5'-gelegenen Bereich stromaufwärts des menschlichen FMR1 Gens bindet spezifisch Kernproteine.
Auch in verschiedenen Geweben der Maus konnte eine deutliche Methylierungsgrenze nachgewiesen werden, obwohl die Nukleotid-Sequenz vor der 5'-(CGG)n-3' Repetition des homologen Fmr1 Gens des X-Chromosoms der Maus (A7.1) mit dem menschlichen FMR1 Gen nur zu 46,7% identisch ist.
Der Bereich stromaufwärts des menschlichen Huntingtin Gens (HTT) auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4 (4p16.3), mit einer 5'-(CAG)n-3' Repetition im kodierenden Bereich des ersten Exons, weist ebenfalls eine deutliche Methylierungsgrenze auf.
Die Transformation von menschlichen Zellen ohne FXS durch Epstein-Barr-Virus oder Telomerase führt nicht zur Destabilisierung der Methylierungsgrenze und zur Ausbreitung der DNA-Methylierung in Richtung des FMR1 Promotors. Die eingebrachte fremde DNA führte jedoch in einem unbekannten Mechanismus zu einem Verlust der DNA-Methylierung in dem ursprünglich stark methylierten Bereich, der weiter stromaufwärts zur Methylierungsgrenze liegt. Eine ähnliche Abnahme der Methylierung wurde auch in Zellkultur wachsenden, nicht-transformierten FXS Fibroblastenzellen beobachtet.
Die DNA von FXS Individuen zeichnet sich durch den Verlust der Methylierungsgrenze und Ausbreitung der DNA-Methylierung stromabwärts bis in den FMR1 Promotor aus. Die Analyse der FXS Genome ergab keine Mutationen oder Veränderungen, verglichen mit der normalen DNA-Sequenz des Menschen. Der FXS-assoziierte Verlust der Methylierungsgrenze kann folglich nicht einfach durch eine mutierte Nukleotid-Sequenz erklärt werden.
In dem fast vollständig de novo methylierten FMR1 Promotorbereich in FXS Individuen wurden isoliert nicht-methylierte CpG-Folgen gefunden. Diese isoliert nicht-methylierten CpG-Folgen sind nur bei einer de novo Methylierung in lebenden Säugerzellen und Organismen nachweisbar, aber nicht während der in vitro Methylierung der gleichen FMR1 Sequenz durch die bakterielle SssI-Methylase.
In weiblichen Vollmutations-Trägerinnen war die ursprüngliche Methylierungsgrenze nur noch in wenigen DNA-Molekülen intakt. Bei männlichen wie weiblichen Prämutations-Überträgern konnte eine stabile Methylierungsgrenze nachgewiesen werden, ebenso in den männlichen Vollmutations-Trägern ohne FXS aber mit expandierter 5'-(CGG)n-3' Repetition, den sogenannten high-functioning males (HFM).
Eine stabile Methylierungsgrenze in den HFM scheint von wesentlicher Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des FMR1 Promotors zu sein. Die Wichtigkeit der Methylierungsgrenze wird zudem unterstützt durch den Verlust der Methylierungsgrenze im regulatorischen Bereich des Entwicklungs-relevanten menschlichen FMR1 Gens im fragilen X Syndrom. Eine spezifische Chromatinstruktur im Bereich der Methylierungsgrenze könnte für die Stabilität verantwortlich sein und eine Ausbreitung der DNA-Methylierung über die Promotorregion des FMR1, Fmr1 und HTT Gens verhindern. Die Aufrechterhaltung der Methylierungsgrenze des FMR1 Gens könnte somit ein wichtiger Faktor für den Schutz gegen das fragile X Syndrom sein
