Martins Feitosa, Natália

English

Kölner UniversitätsPublikationsServer

Genetic analyses of Hemicentin and its interaction with extracellular matrix proteins in zebrafish and mouse

Summary  5 Summary  The extracellular matrix (ECM), and particularly the basement membrane (BM), play pivotal roles during development and homeostasis of a variety of tissues. The BM is a complex structure composed of many tightly associated and regulated proteins, which contribute to its integrity, strength and flexibility. Human disorders, which involve impaired BM integrity or strength, lead to complex, debilitating symptoms, which can affect multiple tissues in the body. One example is Fraser syndrome; an autosomal recessive congenital disorder resulting from mutations in the Fraser genes encoding the BM-associated proteins, Fras1 or Frem2. This disorder is characterized by multiple developmental defects including cryptophthalmos (fusion of the eyelids), syndactyly (fusion of the digits) and renal defects. Mouse models of Fraser syndrome demonstrated that cryptophthalmos and syndactyly are most likely caused by locally restricted transient embryonic blistering at the BM-dermal junction at corresponding positions of the skin above the eye and limb anlagen. More recently, zebrafish models of Fraser syndrome have been identified, which exhibit similar transient blistering in the embryonic and larval fins. At the same time, other zebrafish mutants with fin blistering were identified, one of which is caused by mutations in the proprotein convertase FurinA, while another is caused by mutations in Hemicentin 1 (Hmcn1), a thus far little investigated member of the fibulin family of ECM proteins. Immunohistochemistry of mutant and chimeric zebrafish embryos revealed that FurinA is required for ectodomain shedding and proper dermal localization of Fras1 protein, and that Frem2 is required for Fras1 stabilisation, consistent with previous findings that mouse Fras1 and Frem2 proteins form a protein complex. In contrast, Fras1 was found to be stable and properly localized in hmcn1 zebrafish mutants, indicating that Hmcn1 is not part of the Fras1/Frem2 complex, but contributes to the BM-dermal junction by other means. To gain more insights into Hemicentin function during vertebrate development, the studies were extended to Hmcn2, a close relative of Hmcn1, and to the mouse. In both zebrafish and mouse, hmcn2 shows an expression pattern partly complementary to that of hmcn1 in mesenchymal versus epithelial compartments of various tissues. Gene-targeted mouse knockouts were generated for both Hmcn1 and Hmcn2. Preliminary macroscopical analyses indicate that loss of either of them does not result in any defects characteristic for Fras1 or Frem2 mutants, but in defects shared by mutants in the ECM protein Fibrillin2, which is a major component of microfibers. Applying morpholino oligonucleotide (MO)-based antisense approaches, the role of Hmcn2 was analysed during zebrafish Summary  6  development. Unlike hmcn1, but like fibulin1 (fbln1), another member of the fibulin family, hmcn2 is predominantly expressed in fin mesenchymal, rather than epidermal cells. In addition, both hmcn2 and fbln1 are expressed in developing somites. While hmcn2 MO-based knockdown did not yield any discernable defects, hmcn2/fbln1 double knockdown fish displayed blistering in the trunk pointing to an essential contribution of these proteins from mesodermal sources for proper BM-dermal junction formation. This phenotype is similar to that previously described for fibrillin2 mutants. Furthermore, hmcn2/fbln1 double knockdown fish displayed impaired migration of fin mesenchymal cells into the fin folds, pointing to a crucial role of Hmcn2 and Fbln1 to remodel the fin fold dermal ECM, which is a prerequisite for fibroblast ingrowth. Results obtained via transmission electron microscopy suggest that this ECM remodeling might occur at the level of cross fibers, which resemble mammalian microfibers. Taken together, the results of this work reveal new and important insights into the previously uncharacterized role of the two hemicentin proteins during vertebrate development, identifying Fibulin1 and Fibrillin2 as potential interaction partners.  Zusammenfassung  7 Zusammenfassung Die extrazelluläre Matrix und im besonderen die Basalmembran (BM) spielen während der Entwicklung und für die Homöostase verschiedener Gewebe eine entscheidende Rolle. Die BM ist eine komplexe Struktur, die aus vielen eng assoziierten Proteinen besteht, die zu ihrer Integrität, Festigkeit und Flexibilität beitragen. Menschliche Syndrome, die zu Störungen der Integrität oder der Festigkeit der BM führen, rufen komplexe Symptomen hervor, die viele verschiedene Gewebe betreffen. Ein Beispiel ist das Fraser-Syndrom, eine autosomale rezessive Erbkrankheit, hervorgerufen durch Mutationen in den Genen der Fraserfamilie Fras1 oder Frem2, die für BM-assozierte Proteine kodieren. Diese Krankheit prägt sich durch multiple Defekte in der Entwicklung aus, wie Cryptothalmos (eine Fusion des Augenlids), Syndactylie (eine Fusion der Finger) und Nierendefekte. Entsprechende Mausmodelle des Frasersyndroms haben gezeigt, dass Cryptothalmos und Syndactylie sehr wahrscheinlich durch Blasen zwischen der BM und der Dermis hervorgerufen werden. Diese bilden sich transient und lokal begrenzt an den jeweiligen Positionen der Haut über dem Auge und den Extremitätenanlagen. Vor kurzem wurden Zebrafishmodelle des Frasersyndroms identifiziert, die ähnliche transiente Blasen in embryonalen und larvalen Flossen bilden. Zur gleichen Zeit identifizierte Zebrafischmutanten, die ebenfalls Blasen in den Flossen zeigen, betreffen jedoch andere Gene. Diese Blasen werden durch Mutationen in der Proproteinconvertase FurinA verursacht, oder durch Mutationen in Hemicentin1 (Hmcn1), einem bisher wenig untersuchten Mitglied der Fibulinfamilie der ECM-Proteine. Immunohistologische Färbungen an mutanten und chimären Zebrafishembryonen zeigten auf, dass FurinA notwendig ist, um die Ectodomäne des Fras1-Proteins zu spalten und das Protein korrekt dermal zu lokalisieren. Außerdem wurde durch diese Versuche verdeutlicht, dass Frem2 benötigt wird, um Fras1 zu stablisieren. Das stimmt mit früheren Untersuchungen überein, die zeigten, dass murines Fras1 und Frem2 einen Komplex bilden. Im Gegensatz dazu habe ich herausgefunden, dass Fras1 in hmcn1 Zebrafischmutanten korrekt lokalisert wird,. Das deutet darauf hin, dass Hmcn1 nicht Teil des Fras1/Frem2-Komplex ist, sondern durch andere Mechansimen zur Verbindung zwischen BM und Dermis beiträgt. In dieser Studie habe ich die Rolle von Hmcn1 und dem nahverwandten Hmcn2 während der Entwicklung sowohl von Zebrafish als auch von der Maus analysiert. Desweiteren habe ich Knockoutmäuse für Hmcn1 und Hmcn2 hergestellt. Vorläufige makroskopische Analysen zeigten, dass der Funktionsverlust von keinem der beiden Gene zu den für Fras1 oder Frem2-typischen Charakteristika führt. Die Zusammenfassung  8  Mutanten entwickeln jedoch Defekte, die auch bei Fibrillin2-Mutanten auftreten. Fibrillin2, ein weiteres ECM-Protein, ist eine bedeutende Komponte der Mikrofasern. Um die Rolle von Hmcn2 während der Entwicklung von Zebrafischen zu untersuchen, habe ich einen auf Morpholinooligonukleotiden basierenden Knockdown-Ansatz gewählt. hmcn2 ist im Gegensatz zu hmcn1, jedoch ähnlich wie fibulin1 (fbln1), ein anderes Mitglied der Fibulinfamilie, hauptsächlich in mesechymalen Zellen der Flosse und nicht in epidermalen Zellen exprimiert. Zusätzlich sind sowohl hmcn2 als auch fbln1 in sich entwicklenden Somiten exprimiert. Während der Herunterregulierung von hmcn2 durch Morpholinos keinen erkennbaren Phänptyp hervorruft, zeigten Embryos, bei denen hmnc2 und fbln1 gleichzeitig ausgeschaltet wurden, Blasen am Körper. Das deutet darauf hin, dass diese Proteine aus mesodermalen Ursprung essentiell zur Formierung der Verbindung zwischen BM und Dermis beitragen. Desweiteren war die Migration von mesechymalen Zellen in der Flosse in den Flossensaum gestört. Daher könnten Hmcn2 and Fbln1 eine entscheidende Rolle spielen, die dermale ECM im Flossensaum zu modulieren, was die Vorraussetzung für das Einwandern von Fibroblasten ist. Die Analyse mithilfe von Elektronentransmissionmikroskopie deutet darauf hin, dass das Modulieren der ECM auf der Ebene der cross fibers, stattfindet. Cross fibers sind Fasern, die den Mikrofasern von Säugetieren ähneln. Zusammengefasst geben die Ergebnissen neue Einblicke in vorher noch nicht beschriebene Funktionen der Hemicentin-Proteine während der Entwicklung von Vertebraten.  Außerdem wurden Fibulin1 und Fibrillin2 als mögliche interagierende Partner identifiziert.  

Genetic analyses of Hemicentin and its interaction with extracellular matrix proteins in zebrafish and mouse

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Kölner UniversitätsPublikationsServer

Kölner UniversitätsPublikationsServer