Bechtel, Manuela Christina

German

Kölner UniversitätsPublikationsServer

Zusammenfassung  1  1. Zusammenfassung  Nidogen-1 und -2 sind ubiquitäre Basalmembrankomponenten, denen eine Schlüsselrolle in der Basalmembranbildung zugedacht wurde. Dennoch zeigten Mäuse, die für beide Nidogene defizient sind, oder denen das hoch affine Nidogenbindungsmodul (III4) auf der Laminin 1 Kette fehlt, Basalmembrandefekte und Gewebeabnormalitäten nur in einigen, wenn gleich nicht identischen Organen. Alle diese Tiere sterben kurz nach der Geburt. Eine neue, hier verwendete Mauslinie, der die Nidogenbindungsaktivität fehlt (1N802S-/-), ist im Gegensatz zu den 1III4-/- Mäusen fertil und zeigt keine offensichtlichen Basalmembran-defekte. Diese Mäuse zeigen, wie auch die 1III4-/- Mäuse, eine reduzierte Nidogen-1 Proteinmenge, während die Nidogen-2 Menge unverändert ist. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass Nidogen-1 und -2 verschiedene Laminin-Bindungsstellen oder unter-schiedliche Bindungspartner besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Möglichkeit einer weiteren Laminin-Bindungsstelle und zum anderen die Möglichkeit neuer Bindungspartner für Nidogen-2 untersucht. Immunpräzipitationen mit Nidogen-2 und Laminin 1-Antikörpern zeigten, dass es für Nidogen-2 eine alternative Laminin-Bindungsstelle geben könnte. Mit Massenspektrometrie-Analysen (LC-MS/MS) der präzipitierten Proteine konnte gleichzeitig Perlecan als wahrscheinlich alternativer Bindungspartner für Nidogen-2 identifiziert werden. Um die Rolle der verschiedenen Nidogen-Bindungsdomänen bei der Basalmembranbildung zu untersuchen, wurden Haut-organotypische Kulturen mit Nidogen defizienten Fibroblasten verwendet und diesen die verschiedenen rekombinant hergestellten Nidogendomänen zugesetzt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Nidogen-1 die G2 und G3 Domäne zur Basalmembranbildung benötigt, während Nidogen-2 dies nur über die rod-G3 Domäne ermöglicht. Um Einblick in den Einfluss beider Nidogene auf die Hautreifung zu erhalten, wurde ein Mausstamm mit Haut spezifischer Deletion von Nidogen-1 in einem Nidogen-2 defizienten Hintergrund (NID1fl/-//NID2-/-//COL1A2-CreERT) generiert. Trotz effizienter Deletion des Nidogen-1 in Fibroblasten kam es nach zusätzlicher Deletion von Nidogen-2 zu einer Zunahme der Nidogen-1 Proteinmenge und einer vermehrten Ablagerung in der dermo-epidermalen Basalmembran im Vergleich zu NID1fl/-//COL1A2-CreERT positiven Tieren. Dies deutet auf eine Stabilisierung von Nidogen-1 durch den Verlust von Nidogen-2 hin. Zusammenfassend haben diese Untersuchungen ein unterschiedliches Bindungsverhalten beider Nidogenisoformen gezeigt. Zusammenfassung  2  Ob dies der Grund für die isoformspezifischen Funktionen beider Nidogene ist, muss in weiteren Studien geklärt werden.  Abstract  Nidogen-1 and -2 are ubiquitous basement membrane components which are considered to play a key role in basement membrane assembly. However, mice lacking both nidogens, or the high affinity nidogen binding module (III4) on the laminin 1 chain, showed basement membrane defects and tissue abnormalities only in certain, albeit not identical, organs. All of these animals die shortly after birth. A new mouse line used here which lacks nidogen binding activity (1N802S-/-) in contrast to the 1III4-/- mice, is fertile and shows no obvious basement membrane defects. These mice show, as well as 1III4-/- mice, reduced nidogen-1 protein levels while the amount of nidogen-2 is unaltered. That data suggests different laminin binding sites or different binding partners for nidogen-1 and -2. During this study we analyzed, on the one hand the possibility of another laminin binding site and, on the other hand, the possibility of new binding partners for nidogen-2. Immunoprecipitation with nidogen-2 and laminin 1 antibody showed that an alternative laminin binding site for nidogen-2 could exist. With mass spectrometry analysis (LC-MS/MS) of the precipitated proteins we also identified perlecan as a probable alternative binding partner for nidogen-2. To investigate the role of different nidogen binding domains in basement membrane assembly, skin-organotypic cultures with nidogen deficient fibroblasts supplemented with the different recombinant nidogen domains were used. This showed that for nidogen-1, G2 and G3 domains are needed for basement membrane formation, while nidogen-2 only needs the rod-G3 domain. To get more insight into the influence of both nidogens on skin maturation a mouse strain with a skin specific deletion of nidogen-1 in a nidogen-2 deficient background (NID1fl/-//NID2-/-//COL1A2-CreERT) was generated. Despite the efficient deletion of nidogen-1 in fibroblasts, the additional deletion of nidogen-2 results in an increase in nidogen-1 protein levels and an increased deposition in the dermo-epidermal basement membrane compared to NID1fl/-//COL1A2-CreERT positive animals. This indicates a stabilization of the nidogen-1 protein by the loss of nidogen-2. In summary, these studies have shown a different binding behavior of both nidogen isoforms. If this is the reason for the isoform specific functions of both nidogens must be clarified in further studies.  

Identifizierung von in vivo Bindungspartnern der Basalmembranproteine Nidogen-1 und Nidogen-2

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