Alopecia areata (AA) (MIM 104000) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des aktiv wachsenden Haarfollikels in der Anagenphase mit einer starken genetischen Komponente. Sie ist im Allgemeinen durch einen kreisrunden Haarverlust am Kopf oder aber auch an anderen Körperstellen charakterisiert. Die Krankheitsentstehung ist nach wie vor unklar wobei ein gewebespezifischer Autoimmunmechanismus vermutet wird.
In dieser Studie wurde der Stamm Dundee Experimental Bald Rat (DEBR) als Nagetiermodell für AA verwendet. In vorhergehenden Arbeiten wurde eine Kreuzung von DEB mit PVG Ratten angesetzt aus der 320 weibliche F2 Tiere entstanden. Diese Tiere wurden genomweit mit Mikrosatelliten auf Kopplung getest, was zu einem hoch signifikanten Lokus auf Chromosom 19 mit einem lod score von 20 führte. In dieser Arbeit folgte daher eine Sättigungskartierung für dieses Chromosom mit weiteren Mikrosatellitenmarkern die eine Kandidatenregion bei 33 bis 36.5 Mb (rn4) identifizierte. Exone der meisten Gene innerhalb dieser Region wurden sequenziert wobei keine Mutationen, als potentielle Ursache für Haarausfall, identifiziert werden konnten. Daher wurde die komplette Kandidatenregion erneut mittels Next Generation Sequencing (NGS) sequenziert. Mutationen konnten damit weiterhin nicht identifiziert werden. Einige intergenetische Varianten suggerieren jedoch das Vorkommen von bisher unbekannten Genen innerhalb der Kandidatenregion oder es könnte sich um Mutationen in regulatorischen Elementen wie beispielsweise in Promotor- oder Enhancerregionen handeln. Dies muss in weiteren bioinformatischen Berechnungen geklärt werden.
Zusätzlich zur Sequenzierung wurde ein weiterer Ansatz über die Expressionsanalyse mittels Affymetrix GeneChip Rat Gene 1.0 ST Arrays verfolgt. Diese ließ Abweichungen in der Expression von verschiedenen (Haar-) Keratingenen, Genen von weiteren strukturellen Komponenten sowie immunregulatorische Gene wie Chemokine und H2 Gene, die ortholog zu HLA sind, erkennen. Weitergehende Auswertungen der Expressionsdaten von Genen der Kandidatenregion auf Chromosom 19 mit dem Programm „Network Explorer“ von Ingenuity Pathways Analysis verwiesen auf eine wichtige Rolle von Cadherinen. Daher wurde ein Set aus Cadherinen, Cateninen und Desmogleinen immunohistochemisch in Hautproben gefärbt. Dieses Experiment zeigte eine Reduzierung in der Konzentration von Catenin gamma in Korrespondenz zum Phänotyp. In Proben von Ratten mit einem ausgeprägten Haarverlust war Catenin gamma nicht mehr nachweisbar. Zusätzlich zu Catenin gamma zeigte M- und P-Cadherin ebenfalls eine abnormale Proteinlokalisierung in der humanen Epidermis der Haut. Die Resultate der Expressionsanalyse von Kandidatengenen wurden schließlich in Rattenhaut und teilweise auch in Herzproben mittels qRT-PCR (Light Cycler 480 System von Roche) validiert und verfeinert. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse und der Färbungen weisen auf eine Beteiligung des Wnt/Catenin beta Signalweges und einem Defekt in den Zell-Zell-Verbindungsstrukturen in der Krankheitsentwicklung von Alopezie hin. Im nächsten Schritt werden immunohisto-chemische Färbungen in Rattenhaut in verschiedener Stadien von Haarverlust wiederholt und elektronenmikroskopisch untersucht, wobei der Fokus auf Desmosomen der Haarfollikel und der Epidermis liegt, um ein tiefergehendes Verständnis in die strukturellen Defekte der Zell-Zell-Verbindungskomplexe und dem Zeitpunkt der Zerstörung zu bekommen.
Eine genomweite Kopplungsanalyse mit SNP Marker wurde im Vorfeld zu dieser Studie mit humanen Proben durchgeführt, die auf einen signifikanten Lokus auf Chromosom 19 verwies. Im Rahmen dieser Studie wurde eine Feinkartierung dieses Lokus auf Chromosom 19 in 301 Familien (1131 Individuen) mittels SNPstream, Taqman und Pyrosequencing durchgeführt. Eine Kopplungsanalyse identifizierte eine Kandidatenregion bei 37 bis 38 Mb (GRCH37), welche mehrere Zinkfingergene beinhaltet. Die höchsten nichtparametrischen lod scores wurden für SNPs in oder nahe der Gene ZNF567 und ZNF568 erzielt. Daher wurden diese Gene auf Mutationen mittels Schmelzkurvenanalyse und Sequenzierung untersucht. Es konnten keine Mutationen gefunden werden, da alle aufgetretenen Varianten auf bekannte SNPs zurückzuführen sind.
Zusätzlich wurden für eine SNP basierte genomweite Assoziationsstudie (GWAS) mit 357 Fällen und 2534 Kontrollen weitere Proben gesammelt und mit Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 genotypisiert. Signifikante assoziierte Loci wurden für die Chromosomen 5, 6 (welches die HLA Region beinhaltet) und 16 (CLEC16A) ausfindig gemacht. Außerdem resultierte eine Kopplungsanalyse mit 259 Familien mit 855 Individuen in einer signifikanten Region auf Chromosom 10 und 19 (Zinkfingerregion). Mit einer definierten Auswahl an SNP Marker wurde eine Kandidatenregion bei 35.9 Mb bis 36.5 Mb (GRCH37) auf Chromosom 19 identifiziert. In einem nächsten Schritt wird die kombinierte Region von 35.9 Mb bis 38 Mb in Gänze mit NGS sequenziert und nach Mutationen untersucht.
Abschließend weist die vorliegende Studie auf eine starke Assoziation von zellulären Defekten in der Haut mit der Krankheit hin, was in weiterführenden Experimenten mit dem Rattenmodell DEBR in der Dermatogenetikgruppe des CCG weitergehend untersucht werden wird. Zusätzlich zu den bereits bekannten immunoregulatorischen Genen, die mit AA assoziiert sind, konnte diese Studie signifikante Kopplungsbefunde für Loci auf Chromosom 10 und besonders für Chromosom 19, welche ein Zinkfingercluster beinhaltet, ausfindig machen. Diese Resultate machen erneut deutlich, dass mehrere komplexe Mechanismen zu der Suszeptibilität der Krankheit beitragen
