Massenspektrometrische Charakterisierung endogener Wachstumshormonvarianten und Entwicklung einer Methode zum Nachweis rekombinanten Wachstumshormons in humanem Plasma mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese zum Einsatz in der Dopinganalytik

Abstract

Humanes endogenes Wachstumshormon wird in der Hypophyse produziert und ist einer der wichtigsten Wachstumsregulatoren im menschlichen Körper. Außerdem hat Wachstums¬hormon eine Fülle metabolischer Funktionen wie Fettabbau und Muskelaufbau und hat Einfluss auf den Knochen- sowie Mineralstoffhaushalt. Besonders aufgrund der endokrino¬logischen Wirkungen auf Lipolyse und Proteinanabolismus wird Wachstums¬hormon im Sport zur Leistungssteigerung eingesetzt, und dessen Verwendung ist von der Welt Anti-Doping Agentur (WADA) verboten. Endogenes Wachstumshormon ist ein heterogenes Protein und besteht aus vielen Varianten und Fragmenten. Die Hauptform, die etwa 90% des Wachstumshormons im Körper ausmacht, ist 22 kDa groß und entspricht dem rekombinanten Wachstumshormon. Andere bereits identifizierte Formen sind eine 20 kDa Splice-Variante, phosphorylierte und deamidierte Formen und Fragmente sowie Polymere. Eine Testmethode zur Detektion rekombinanten Wachstumshormons muss daher die niederkonzentrierten, für endogenes Wachstumshormon spezifischen Formen detektieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Dopingkontrollmethode entwickelt, die Wachstumshomon aus humanem Plasma durch Immunoaffinitätsaufreinigung, 2D-Elektrophorese und Immunoblot detektiert und die Unterscheidung von endogenem und rekombinantem Wachstumshormon ermöglicht. Des Weiteren wurden die in der Methode detektierten endogenen Formen mittels hochauflösender/hochakkurater Massenspektrometrie identifiziert. Die Immunoaffinitätsaufreinigung dient zur Isolation des Wachstumshormons und des zugegebenen internen Standards (plazentares Laktogen) mittels eines polyklonalen anti-Wachstumshormon-Antikörpers und, an einen sekundären Antikörper gekoppelten, magnetischen Beads. Nach Auftrennung mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese werden die Proteine mittels Immunoblot und Chemilumineszenzreaktion visualisiert. Die Prozedur detektiert bis zu vier endogene Wachstumshormonvarianten, erlaubt die Analyse von sechs Proben in einer Aufarbeitung und nimmt 2 ½ Tage in Anspruch. Die Methode wurde unter Berücksichtigung der analytischen Parameter Spezifität, Linearität, Nachweisgrenze (0,3 ng/ml), Präzision (14%) und Wiederfindung (30%) validiert. Der Einfluss einer belastungsinduzierten Wachstumshormonausschüttung auf die Detektion unterschiedlicher Varianten wurde mittels eines Belastungstests geprüft und ergab keine Diskriminierung endogener Formen. Um Grenzwerte für die Präsenz rekombinanten Wachstumshormons in einer Probe festlegen zu können wurden Proben einer Referenzgruppe gesunder Probanden sowie Proben von Patienten gemessen, die rekombinantes Wachstumshormon applizieren. Aus der Referenzpopulation wurde ein Unterscheidungslimit von 0,52 für das auf den internen Standard normierte Spotvolumen der 22 kDa-Hauptform errechnet. Proben mit einem normierten Spotvolumen der 22 kDa-Hauptform > 0,52 müssen, wenn sie endogenes Wachstumshormon enthalten, mindestens eine weitere Form (die 20 kDa Splice-Variante) zeigen. Ist dies nicht der Fall, wird die Schlussfolgerung gezogen, dass die Probe rekombinantes Wachstumshormon enthält. Die Werte der analysierten Patientenproben lagen weit über dem Unterscheidungslimit und konnten eindeutig als Proben identifiziert werden, die rekombinantes Wachstumshormon enthalten. Der entwickelte Test ist damit eine wertvolle Ergänzung und sollte als Bestätigungsmethode zu dem bisher verwendeten Immunoassay eingesetzt werden. Die massenspektrometrische Identifizierung konzentrierte sich auf die vier endogenen Spots, die in der Dopingkontrollmethode detektiert werden. Diese wurden identifiziert als 1) 22 kDa-Hauptform, 2) 20 kDa Splice-Variante, 3) phosphorylierte Form mit Modifikationen an Serin 106 und 150 und 4) einer glykosylierten Form, die vermutlich an Threonin 60 modifiziert ist. Die Glykosylierung ist eine O-Glykosylierung vom Mucin-Typ und die Strukur wurde als Verknüpfung einer Hexose (Hex) mit einem N-acetylierten Hexosamin (HexNac) und zwei Sialinsäuren (NeuAc) identifiziert. Zusätzlich wurden Fragmente mit 9 und 12 kDa sowie unterschiedliche oxidierte Formen detektiert. Die massenspektrometrische Charakterisierung von Varianten und Isoformen, die in einer auf immunologischen Techniken beruhenden Methode detektiert werden, ist entscheidend, um Ergebnisse bewerten und ungewöhnliche Werte besser einordnen zu können. Des Weiteren kann die Identifizierung neuer Varianten eines Proteins zur Aufklärung von Funktionen und Signalwegen beitragen. Damit sind die hier vorgestellten Ergebnisse sowohl für die Dopinganalytik als auch für die Endokrinologie sehr bedeutsam