thesis

Die Transkriptions-Regulation des EGFR-Zielgens pipe und Analyse der KASH- und der SUN-Domänen-Proteine in der Oogenese von Drosophila melanogaster

Abstract

Diese Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Der erste Teil befasst sich mit der Transkriptionsregulation des Gens pipe, dessen spezifische Expression in ventralen Follikelzellen der Eikammer für die Bildung der dorsoventralen Achse des Drosophila-Embryos entscheidend ist. Die Repression der pipe Expression in dorsalen Follikelzellen hängt von der Aktivierung des EGF-Rezeptors durch den, in der Oocyte asymmetrisch lokalisierten, TGF-alpha-artigen Liganden Gurken ab. Der Einfluss verschiedener Kandidaten der pipe Transkriptionsregulation wurde von uns mittels klonaler Analyse getestet. Dabei zeigte sich, dass alle EGFR-regulierten Transkriptionsfaktoren, für die eine mögliche Rolle bei der Kontrolle der pipe Expression vermutet worden ist, nicht für die EGFR-Signal vermittelte, dorsale Repression von pipe verantwortlich sind. Parallel zu diesen Experimenten wurde die cis-regulatorische Region von pipe außerdem mit Hilfe bioinformatischer Methoden, basierend auf der evolutionären Konservierung funktionaler Elemente (phylogenetic footprinting), sowie durch die Analyse einer Reihe von Promotor-Reporter-Konstrukten untersucht. Dadurch konnten wir ein cis-regulatorisches Element von 31bp identifizieren, welches für die dorsale Repression von pipe eine essentielle Rolle spielt. In Gelretardationsexperimenten konnten wir in vitro eine spezifische Bindung von Proteinen aus Extrakten von Ovarien an dieses Element nachweisen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse der KASH (Klarsicht/Anc-1/Syne Homologie)- und SUN (Sad1/UNC-84)-Domänen-Proteine in Drosophila. KASH-Domänen-Proteine anderer Organismen lokalisieren an der äußeren Kernmembran und spielen unter anderem eine Rolle bei der Verknüpfung des Zellkerns mit Cytoskelett-Elementen; wir waren daher insbesondere an einer möglichen Funktion dieser Proteine bei der Kernpositionierung in der Oogenese interessiert. In C elegans und in Vertebraten hängt die Membran-Lokalisation der KASH-Proteine von einer direkten Interaktion mit den SUN-Proteinen ab, die in der inneren Kernmembran lokalisiert sind. In Drosophila findet man zwei KASH-Proteine, Msp-300 und Klarsicht (Klar), sowie zwei SUN-Proteine CG18584/CG3287 (auch Klaroid, Koi) und CG6589, von denen CG6589 jedoch nur in Männchen exprimiert wird. Bisher ist nur Klar intensiv untersucht worden, welches unter anderem eine Rolle bei der Kernwanderung während der Augenentwicklung spielt. Wir haben Deletionen von Msp-300 und CG18584/CG3287 generiert. Die Gesamtdeletion von Msp-300 führt zu larvaler Letalität, Teildeletionen deuten darauf hin, dass Msp-300-Protein-Isoformen ohne eine KASH-Domäne in Drosophila eine essentielle Funktion haben. Msp-300 und Klar werden während der Oogenese exprimiert und lokalisieren in den Nährzellen und der Oocyte an der Kernhülle. Der gleichzeitige Funktionsverlust beider KASH- Proteine hat jedoch keine Auswirkungen auf die Oogenese. Damit konnten wir eine frühere Veröffentlichung widerlegen, die eine Funktion von Msp-300 bei der Positionierung der Nährzellkerne aufzeigt. Die Deletion des SUN-Homologs CG18584/CG3287 führt zu einem Verlust der Kernmembran-Lokalisation beider KASH-Proteine. Die Funktion der SUN-Proteine bei der Lokalisation der KASH-Proteine ist somit auch in Drosophila konserviert. Die Deletion des SUN-Domänen-Homologs ist semilethal und homozygote Fliegen zeigen einen klar-identischen Augenphänotyp, die Oogenese ist in homozygoten Weibchen jedoch nicht betroffen. Auch CG18584/CG3287 hat somit keine essentielle Funktion in der Oogenese

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