山田 憲吾

筑波大学University of Tsukuba博士（農学）Doctor of Philosophy in Agricultural Science2017【要旨】thesi

山田, 憲吾

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

チャ輪斑病菌のQoI剤耐性に関する研究著者 山田 憲吾発行年 2018学位授与大学 筑波大学 (University of Tsukuba)学位授与年度 2017報告番号 12102乙第2867号URL http://hdl.handle.net/2241/00152929                                                         氏名            山田 憲吾        学位の種類          博 士（ 農学 ）     学位記番号          博 乙 第  ２８６７  号     学位授与年月日      平成 ３０年 ３月 ２３日     学位授与の要件      学位規則第４条第２項該当     審査研究科      生命環境科学研究科     学位論文題目     チャ輪斑病菌のQoI剤耐性に関する研究      主査            筑波大学教授       農学博士  山岡 裕一     副査            筑波大学教授       農学博士  戒能 洋一     副査            筑波大学准教授      博士(農学） 岡根  泉     副査            筑波大学准教授      博士(理学)  山田 小須弥     副査            吉備国際大学地域創成農学部教授 農学博士  石井 英夫                   論   文   の   要   旨    本論文は、我が国最大の茶産地である静岡県牧ノ原台地におけるチャ輪斑病菌の QoI剤耐性菌の発生実態を把握し、その耐性菌の特性ならびに集団構造を明らかにするとともに、今後の耐性菌対策に必要な迅速あるいは簡便な薬剤感受性検定法を開発し、本病害の防除対策に資することを目的としたものである。  チャ輪斑病は、糸状菌 Pestalotiopsis longisetaにより引き起こされるチャの重要病害の一つである。その防除には、病原菌のミトコンドリアの複合体 IIIの Qo部位に結合して電子伝達系を阻害する QoI剤の１種、アゾキシストロビン水和剤が基幹防除薬剤として広く使用されている。ところが、2008年に鹿児島県において QoI剤耐性菌(以下、耐性菌)の出現が確認され、その分布拡大が懸念されていたが、その他の地域での耐性菌発生実態は不明であった。そこで著者は、本病原菌の薬剤耐性対策に資するため、以下の研究を実施し、論文としてまとめた。本論文の第 1章では、我が国におけるチャの栽培体系の変化に伴う重要病害の変遷と防除方法について解説し、チャ輪斑病の薬剤耐性対策が現在の重要課題であることを明確に示した。そして、第２章では静岡県牧ノ原台地における耐性菌の発生実態の把握、第３章では調査過程で新たに発見された中等度耐性菌の諸性質の解明、第４章では現場での継続的な病原菌の薬剤感受性モニタリングを可能とする新しい薬剤感受性検定法の開発、第５章では耐性菌の集団遺伝学的解析に基づく耐性菌の出現および分布拡大経路の推定を行い、第６章ではこれらの基礎情報に基づき本病原菌の薬剤耐性対策について総合的に論じている。  著者は、まずチャ輪斑病菌の耐性菌を検出するための感受性統一検定法を策定し、この方法を用いて、2009年〜2013年にかけて牧ノ原台地の 457圃場より分離した本病原菌、10,528菌株の検定を行った。その結果、耐性菌株率は 24.4%となり、266圃場から耐性菌が検出され、そのうち 103圃場で耐性菌株率が 50%以上であった。同様な調査を静岡県内の他の地域でも実施した結果、耐性菌が検出され、すでに耐性菌が静岡県内ほぼ全域に蔓延していることを明らかにした。  この調査中に、著者は、既知の高度耐性菌の他に中等度の耐性菌が存在することを発見した。高度耐性菌が QoI剤の作用点であるチトクローム bの遺伝子（cytb）の G143A変異（コドン 143に相当する箇所の塩基配列が変異し、推定アミノ酸がグリシンからアラニンに置換）に起因するのに対し、中等度耐性菌は F129L変異（コドン 129に相当する箇所の塩基配列が変異し、推定アミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換）に起因していることを明らかにした。  病原菌の薬剤耐性対策においては、圃場での継続的な病原菌の薬剤感受性モニタリングを行い、いち早く耐性菌を検出する必要がある。そのために、普及・指導機関や生産者が容易に実施できる検定法が求められていた。そこで著者は、従来の寒天培地の代わりに煮沸したチャ葉を培養基質として用いる煮沸チャ葉法を開発した。この方法は専門的な知識・技術や機器・試薬が不要で、容易に検定ができるため、現場で簡単に実施できる検定法である。一方、専門機関で実施する検定では迅速且つ正確な検定法が求められる。著者はマルチプレックス PCR-RFLP分析による遺伝子診断法を開発し、迅速かつ正確に耐性菌を検出することを可能にした。  また、著者は、耐性菌の分布拡大経路を推定するため、マイクロサテライトの塩基配列を利用した ISSR分析による牧ノ原台地における本病原菌の集団遺伝学的解析を行った。その結果、42 種類の ISSR 型を検出し、その解析結果より、牧ノ原台地の各地域にそれぞれ異なる少数の ISSR型が優占していること、同一耕作者の圃場では集団遺伝構造が極めて類似する一方、耕作者間で有意な集団間分化が認められることを明らかにした。このことから、著者は牧ノ原台地の耐性菌は各地域で独立して起こった突然変異によって出現したか、外部から移入したものであると推測した。また、その伝搬距離は比較的短いものの、その伝搬には雨滴による分生子の自然伝搬が寄与していること、ならびに従来から指摘されている摘採機を介した人為的伝播が大きく影響していることを指摘した。  以上の研究成果から、著者は耐性菌が未発生の地域であっても QoI剤を使用している限りは常に耐性菌の出現および発達を警戒する必要があり、継続的な病原菌の薬剤感受性モニタリングや薬剤の使用方法の検討、耕種的防除法の応用など、地域全体で取り組む必要があるとの防除指針を示した。                   審   査   の   要   旨   著者は、チャの重要病害を引き起こすチャ輪斑病菌の QoI剤耐性菌発生の問題に着目し、我が国最大の茶産地である静岡県牧ノ原台地に出現した耐性菌の分布や頻度などの実態を明らかにし、その問題の深刻さを明確にした。耐性菌の中には、既存の高度耐性菌に加えこれまでの報告にない中等度耐性菌が存在し、これが既存の高度耐性菌とは異なる遺伝子変異によって出現したことを明らかにした。また、集団遺伝学的解析の結果から、この地域に出現した耐性菌は、限られた集団が分布拡大したのではなく、異なる圃場で独立して起きた突然変異によって出現したか、あるいは外部からの移入によるものであると推察した。各耐性菌系統の分散の範囲は比較的限られており、雨滴による分生子の自然伝搬の他、摘採機を介した人為的伝播の影響が大きいことを示した。耐性菌の出現から分布拡大、および各耐性菌の諸性質に関するこれらの知見は、今後の輪斑病菌の薬剤耐性対策を考える上で極めて重要な基礎情報である。また、現場で簡易に耐性菌を検出できる煮沸チャ葉法や専門機関で迅速かつ正確に検出できるマルチプレックス PCR-RFLP法の開発は、新たな耐性菌の出現や分布拡大の検出に大きく貢献することが期待される。本論文の成果は、今後の薬剤耐性菌対策に大きく貢献するものと高く評価することができる。  平成30年 1月15日、学位論文審査委員会において、審査委員全員出席のもとに論文の審査及び学力の確認を行い、本論文について著者に説明を求め、関連事項について質疑応答を行った。その結果、審査委員全員によって合格と判定された。 よって、著者は博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものとして認める。            

チャ輪斑病菌のQoI剤耐性に関する研究

筑波大学University of Tsukuba博士（農学）Doctor of Philosophy in Agricultural Science2017doctoral thesi

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